Laboratoriekonstruerade plasmider, en arbetshäst av modern biologi, har problem. Forskare genomförde en systematisk bedömning av cirkulära DNA -strukturer genom att analysera mer än 2500 plasmider tillverkade i laboratorier och skickas till ett företag som tillhandahåller tjänster som förpackning av strukturerna inom virus så att de kan användas som genterapier. Teamet fann att nästan hälften av plasmiderna hade designfel, inklusive fel i sekvenser som är kritiska för uttrycket av en terapeutisk gen. Forskarna publicerade sina resultat förra månaden på PrePrint Server Biorxiv 1.

Studien avslöjar "brist på kunskap" om att genomföra korrekt kvalitetskontroll av plasmider i laboratoriet, säger Hiroyuki Nakai, en genetiker vid Health & Science University i Oregon som inte var involverad i arbetet. Han hade redan lagt märke till problem med lab-tillverkade plasmider, men blev förvånad över frekvensen av fel som upptäcktes av studien. Det finns troligtvis många vetenskapliga artiklar som har publicerats för vilka resultaten inte är reproducerbara på grund av fel i plasmiddesign, tillägger han.

Slösad tid

Plasmider är populära verktyg i biologiska laboratorier, som bakterier, inklusive den allmänt använda modellorganismenEscherichia coli, som använder strukturer för att lagra och utbyta gener. Detta innebär att biologer kan skapa designerplasmider som innehåller olika gener av intresse och sedanE.coliÖvertala dem att spela in dessa och göra många kopior av dem.

Bruce Lahn, chefforskare vid VectorBuilder, ett Chicago, Illinois-baserat företag som tillhandahåller genleveransverktyg, säger att han och andra biologer har märkt problem med plasmidkvalitet i flera år. När Lahn var professor vid University of Chicago tillbringade en doktorand i sitt laboratorium sex månader på att reproducera två plasmider som hade rapporterats i den vetenskapliga litteraturen. "Vi tänkte inte på kvaliteten på plasmiderna, men då fungerade experimentet inte" eftersom plasmiderna innehöll fel, säger han.

Nu på VectorBuilder säger Lahn att han ser problemet hela tiden - så han beslutade att systematiskt utvärdera det. När kunder skickar felaktiga plasmider, "slösar de mycket tid", och de extra stegen i kvalitetskontroll ökar kostnaden för att producera plasmiderna och förpacka dem i virus, säger han.

VectorBuilder -teamets analys avslöjade en hodgepodge av fel i de mer än 2500 plasmiderna utvärderade. Vissa innehöll gener som kodade proteiner som var ansvariga förE.colivar giftiga, vilket innebär att de kunde bromsa eller stoppa tillväxten av de organismer som biologer litar på för att replikera sina plasmider. Andra, avsedda för förpackningar i virus, kodade proteiner som var giftiga för dessa virus. Och vissa innehöll repetitiva DNA -sekvenser som kan ackumulera mutationer i plasmider.

Kontrollfel

De vanligaste felen som Lahn och hans kollegor hittades var associerade med ett nyckelgenterapiverktyg. Terapier förpackas ofta i adeno-associerade virus (AAV), som mestadels är ofarliga och kan leverera behandlingar till celler. När de skapar plasmiderna för dessa AAV: er, smörjer forskare en terapeutisk gen mellan sekvenser som kallas ITR, som spelar en kritisk roll för att säkerställa att genen är förpackad i viruset för leverans. Dessa sekvenser skickar i huvudsak en biologisk signal till celler som säger "Jag hör hemma i detta virus." Teamet fann emellertid att cirka 40% av AAV -plasmiderna i studien hade mutationer i ITR -regionerna som kunde förvränga detta viktiga budskap. Om forskare använde dessa felaktiga plasmider kanske deras genterapi inte fungerar - och det kan ta lång tid för forskare att ta reda på varför.

Mark Kay, en pediatrik och genetikspecialist vid Stanford School of Medicine i Kalifornien, har också sett från första hand att plasmidfel kan försena laboratorieprojekt. Han är dock övertygad om att forskare kan identifiera och korrigera dessa fel. Han säger att forskare av genterapi är medvetna om möjliga ITR -problem och att fel är osannolika i kliniska miljöer. Det beror på att tillsynsmyndigheter som US Food and Drug Administration har strikta standarder som kräver att forskare noggrant analyserar sina plasmider innan de använder dem i kliniken.

Nakai säger att kontrollera plasmider för fel genom sekvensering kan varna forskare om de problem som lyfts fram i studien. Vissa företag, inklusive Plasmidsaurus i Eugene, Oregon, och Elim Biopharmaceuticals i Hayward, Kalifornien, erbjuder plasmidsekvensering för cirka $ 15,00 per prov, säger Nakai, som inte har något ekonomiskt intresse i något företag. Han rekommenderar också att nya labbmedlemmar spenderar tid på att lära av erfarna plasmiddesigners; Det är en mödosam, handgjord process, säger han, men om du gör ett misstag kan det slösa en enorm tid och pengar.

Ett annat sätt för laboratorier att undvika problem är att göra sina plasmidsekvenser offentligt tillgängliga i förvar med öppen åtkomst, säger Melina Fan, Chief Scientific Officer vid ideell addgen i Watertown, Massachusetts. Addgene tillhandahåller ett sådant förvar, säger Fan, och det "sekvenserar de avsatta plasmiderna och delar sekvensdata via webbplatsen för gemenskapsbruk." Att kontrollera plasmider är viktigt, tillägger hon.

Lahn hoppas att hans teams analys uppmärksammar forskarnas uppmärksamhet på det faktum att dessa arbetshäst -labbverktyg ofta tas för givet. "Verktygets hälsa är något som folk inte tänker på," säger han, även om de borde göra det.