Plazmidi z laboratorijsko inženirstvom, delovni konj sodobne biologije, imajo težave. Raziskovalci so sistematično ocenili krožne strukture DNK z analizo več kot 2500 plazmidov, narejenih v laboratorijih, in poslali podjetju, ki zagotavlja storitve, kot je pakiranje struktur znotraj virusov, tako da jih je mogoče uporabiti kot genske terapije. Ekipa je ugotovila, da ima skoraj polovica plazmidov napake v oblikovanju, vključno z napakami v zaporedjih, ki so ključne za izražanje terapevtskega gena. Raziskovalci so prejšnji mesec objavili svoje rezultate na predtrintnem strežniku Biorxiv 1.

Študija izpostavlja "pomanjkanje znanja" o izvajanju pravilnega nadzora kakovosti plazmidov v laboratoriju, pravi Hiroyuki Nakai, genetik na univerzi Health & Science v Oregonu, ki ni bil vključen v delo. Opazil je že težave z laboratorijskimi plazmidi, vendar je bila presenečena nad pogostostjo napak, ki jih je odkrila študija. Verjetno je veliko znanstvenih prispevkov, ki so bili objavljeni, za katere rezultati niso ponovljivi zaradi napak pri oblikovanju plazmida, dodaja.

Zapravljen čas

Plazmidi so priljubljena orodja v bioloških laboratorijih, kot bakterije, vključno z široko uporabljenim modelnim organizmomEscherichia coli, ki uporabljajo strukture za shranjevanje in izmenjavo genov. To pomeni, da lahko biologi ustvarijo oblikovalske plazmide, ki vsebujejo različne zanimive gene, in natoE.ColiPrepričajte jih, da jih posnamejo in naredijo številne kopije.

Bruce Lahn, glavni znanstvenik v podjetju Vectorbuilder, Chicago, podjetje s sedežem v Illinoisu, ki ponuja orodja za dostavo genov, pravi, da on in drugi biologi že leta opazujejo težave s kakovostjo plazmida. Ko je bil Lahn profesor na univerzi v Chicagu, je podiplomski študent v svojem laboratoriju šest mesecev preživel v reprodukciji dveh plazmidov, o katerih so poročali v znanstveni literaturi. "Nismo razmišljali o kakovosti plazmidov, potem pa poskus ni deloval", ker so plazmidi vsebovali napake, pravi.

Zdaj v Vectorbuilderju Lahn pravi, da ves čas vidi težavo - zato se je odločil, da ga sistematično oceni. Ko kupci oddajo okvarjene plazmide, "zapravljajo veliko časa", dodatni koraki pri nadzoru kakovosti pa povečajo stroške proizvodnje plazmidov in pakiranja v viruse, pravi.

Analiza ekipe VectorBuilder je pokazala, da so napake v več kot 2500 plazmidih ocenjene. Nekateri so vsebovali gene, ki so kodirali beljakovine, ki so odgovorniE.Coliso bili strupeni, kar pomeni, da bi lahko upočasnili ali ustavili rast organizmov, na katere se biologi zanašajo, da bi ponovili svoje plazmide. Drugi, namenjeni embalaži v viruse, kodirani beljakovine, ki so bile strupene za te viruse. In nekatere so vsebovale ponavljajoče se zaporedje DNK, ki lahko kopičijo mutacije v plazmidih.

Preverjanje napak

Najpogostejše napake Lahn in njegovi sodelavci so bile povezane s ključnim orodjem za gensko terapijo. Terapije so pogosto pakirane v adeno povezane viruse (AAV), ki so večinoma neškodljivi in ​​lahko dovajajo zdravljenje s celicami. Pri ustvarjanju plazmidov za te AAV raziskovalci sendvičijo terapevtski gen med sekvencami, imenovanim ITR, ki igrajo kritično vlogo pri zagotavljanju, da je gen v pakiran v virus za dostavo. Te sekvence v bistvu pošiljajo biološki signal celicam, ki pravijo: "Spadam v ta virus." Vendar je skupina ugotovila, da ima približno 40% plazmidov AAV v študiji mutacije v regijah ITR, ki bi lahko izkrivljale to pomembno sporočilo. Če bi raziskovalci uporabili te napačno zasnovane plazmide, njihova genska terapija morda ne bo delovala - in lahko traja veliko časa, da bi znanstveniki ugotovili, zakaj.

Mark Kay, specialist za pediatrijo in genetiko na Medicinski šoli Stanford v Kaliforniji, je iz prve roke videl tudi, da lahko plazmidne napake odložijo laboratorijske projekte. Vendar je prepričan, da lahko znanstveniki prepoznajo in popravijo te napake. Pravi, da se raziskovalci genske terapije zavedajo možnih težav z ITR in da v kliničnih okoljih niso verjetno napake. To je zato, ker imajo regulativne agencije, kot je ameriška uprava za hrano in zdravila, stroge standarde, ki od raziskovalcev zahtevajo, da skrbno analizirajo svoje plazmide, preden jih uporabljajo na kliniki.

Nakai pravi, da bi lahko preverjanje plazmidov za napake s sekvenciranjem opozorilo raziskovalce na težave, poudarjene v študiji. Nekatera podjetja, vključno s Plazmidsaurusom v Eugeneu v Oregonu, in Elim Biopharmaceuticals v Haywardu v Kaliforniji ponujajo zaporedje plazmidov za približno 15,00 USD na vzorec, pravi Nakai, ki nima finančnega interesa za katero koli podjetje. Priporoča tudi, da novi člani laboratorija preživijo čas za učenje izkušenih plazmidnih oblikovalcev; To je naporen, ročno izdelan postopek, pravi, toda če se zmotite, lahko zapravite ogromno časa in denarja.

Drug način, da se laboratoriji izognejo težavam, je, da so njihove plazmidne zaporedje javno dostopne v skladiščih z odprtim dostopom, pravi Melina Fan, glavna znanstvena direktorica neprofitne Addgene v Watertownu v Massachusettsu. Addgene ponuja takšno skladišče, pravi oboževalec in "sekvencira deponirane plazmide in deli podatke zaporedja prek spletnega mesta za uporabo v skupnosti." Preverjanje plazmidov je pomembno, dodaja.

Lahn upa, da analiza njegove ekipe opozarja raziskovalce na dejstvo, da se ta laboratorijska orodja Workhorse pogosto jemljejo za samoumevno. "Zdravje orodja je nekaj, o čemer ljudje ne razmišljajo," pravi, čeprav bi morali.