Laboratórne inžinierované plazmidy, pracovný kôň modernej biológie, majú problémy. Vedci vykonali systematické hodnotenie štruktúr kruhovej DNA analýzou viac ako 2 500 plazmidov vyrobených v laboratóriách a odoslané spoločnosti, ktorá poskytuje služby, ako je napríklad balenia štruktúr v rámci vírusov, aby sa mohli použiť ako génové terapie. Tím zistil, že takmer polovica plazmidov mala chyby v dizajne, vrátane chýb v sekvenciách kritických pre expresiu terapeutického génu. Vedci publikovali svoje výsledky minulý mesiac na predtlačovom serveri Biorxiv 1.

Štúdia odhaľuje „nedostatok vedomostí“ o vykonávaní správnej kontroly kvality plazmidov v laboratóriu, hovorí Hiroyuki Nakai, genetik na Univerzite v oblasti zdravia a vedy v Oregone, ktorý sa do práce nezúčastnil. Už si všimol problémy s laboratórnymi plazmidmi, ale bol prekvapený frekvenciou chýb odhalil v štúdii. Pravdepodobne existuje veľa vedeckých prác, ktoré boli publikované, pre ktoré výsledky nie sú reprodukovateľné v dôsledku chýb v dizajne plazmidov.

Stratený čas

Plazmidy sú populárne nástroje v biologických laboratóriách, ako baktérie vrátane široko používaného modelu organizmuEscherichia coli, ktoré používajú štruktúry na ukladanie a výmenu génov. To znamená, že biológovia môžu vytvárať dizajnérske plazmidy, ktoré obsahujú rôzne záujmové gény, a potomE.ColiPresvedčte ich, aby ich zaznamenali a vytvorili ich veľa kópií.

Bruce Lahn, hlavný vedec spoločnosti Vectorbuilder, spoločnosť so sídlom v Illinois, ktorá poskytuje nástroje na dodávanie génov, tvrdí, že on a ďalší biológovia si roky všimli problémy s kvalitou plazmidu. Keď bol Lahn profesorom na University of Chicago, postgraduálny študent vo svojom laboratóriu strávil šesť mesiacov reprodukciou dvoch plazmidov, ktoré boli hlásené vo vedeckej literatúre. „Nemyslel sme na kvalitu plazmidov, ale potom experiment nefungoval“, pretože plazmidy obsahovali chyby.

Teraz vo VectorBuilder Lahn hovorí, že problém vidí stále - a tak sa rozhodol systematicky ho vyhodnotiť. Keď zákazníci predkladajú chybné plazmidy, „stratia veľa času“ a ďalšie kroky v kontrole kvality zvýšia náklady na výrobu plazmidov a ich zabalenie do vírusov.

Analýza tímu VectorBuilder odhalila hodgepodge chýb vo viac ako 2 500 hodnotených plazmidoch. Niektoré obsahovali gény, ktoré kódovali proteíny zodpovedné zaE.Coliboli toxické, čo znamená, že dokázali spomaliť alebo zastaviť rast organizmov, na ktoré sa biológovia spoliehajú na replikáciu svojich plazmidov. Iné, určené na balenie do vírusov, kódovali proteíny, ktoré boli pre tieto vírusy toxické. A niektoré obsahovali opakujúce sa sekvencie DNA, ktoré môžu akumulovať mutácie v plazmidoch.

Kontrola chýb

Najčastejšie chyby, ktoré Lahn a jeho kolegovia našli, boli spojené s kľúčovým nástrojom génovej terapie. Terapie sa často zabalia do vírusov spojených s adeno (AAV), ktoré sú väčšinou neškodné a môžu dodávať ošetrenia do buniek. Pri vytváraní plazmidov pre tieto AAV vedci sendviči sendvičujú terapeutický gén medzi sekvenciami nazývanými ITRS, ktoré hrajú rozhodujúcu úlohu pri zabezpečovaní zabezpečenia génu do vírusu na pôrod. Tieto sekvencie v podstate vysielajú biologický signál do buniek, ktorý hovorí: „Patrím do tohto vírusu.“ Tím však zistil, že asi 40% plazmidov AAV v štúdii malo mutácie v oblastiach ITR, ktoré by mohli skresliť túto dôležitú správu. Ak vedci použili tieto nesprávne predložené plazmidy, ich génová terapia nemusí fungovať - ​​a vedci by mohlo trvať dlho, kým zistia, prečo.

Mark Kay, špecialista na pediatriu a genetiku na Stanfordskej lekárskej fakulte v Kalifornii, tiež videl, že chyby plazmidov môžu oneskoriť laboratórne projekty. Je však presvedčený, že vedci môžu tieto chyby identifikovať a opraviť. Hovorí, že vedci génovej terapie sú si vedomí možných problémov ITR a že chyby sú v klinickom prostredí nepravdepodobné. Je to preto, že regulačné agentúry, ako je napríklad americká správa potravín a liečiv, majú prísne štandardy, ktoré vyžadujú, aby vedci starostlivo analyzovali svoje plazmidy pred ich použitím na klinike.

Nakai tvrdí, že kontrola plazmidov z chybov prostredníctvom sekvenovania by mohla výskumných pracovníkov upozorniť na problémy zdôraznené v štúdii. Niektoré spoločnosti vrátane Plasmidsaurus v Eugene, Oregone a Elim Biopharmaceuticals v Hayward v Kalifornii ponúkajú sekvenovanie plazmidov za približne 15,00 dolárov za vzorku, hovorí Nakai, ktorý v žiadnej spoločnosti nemá finančný záujem. Odporúča tiež, aby noví členovia laboratória trávili čas učením sa od skúsených dizajnérov plazmidov; Je to namáhavý, ručne vyrobený proces, hovorí, ale ak urobíte chybu, môže stratiť obrovské množstvo času a peňazí.

Ďalším spôsobom, ako sa laboratóriá vyhnúť problémom, je sprístupnenie ich plazmidových sekvencií v úložiskách s otvoreným prístupom, hovorí Melina Fan, vedecká vedecká pracovníčka neziskovej organizácie Addgene vo Watertown v štáte Massachusetts. Addgene poskytuje takéto úložisko, hovorí fanúšik, a „sekvencie uložené plazmidy a zdieľa sekvenčné údaje prostredníctvom webovej stránky na používanie komunity.“ Kontrola plazmidov je dôležitá, dodáva.

Lahn dúfa, že analýza jeho tímu upúta pozornosť výskumných pracovníkov na skutočnosť, že tieto nástroje Workhorse Lab sa často považujú za samozrejmé. „Zdravie tohto nástroja je niečo, na čo ľudia nemyslia,“ hovorí, aj keď by mali.