Plasmidele proiectate de laborator, un muncitor al biologiei moderne, au probleme. Cercetătorii au efectuat o evaluare sistematică a structurilor ADN circulare prin analizarea a peste 2.500 de plasmide făcute în laboratoare și trimise unei companii care oferă servicii precum ambalarea structurilor din virusuri, astfel încât acestea să poată fi utilizate ca terapii genice. Echipa a constatat că aproape jumătate din plasmide aveau erori de proiectare, inclusiv erori în secvențe critice pentru expresia unei gene terapeutice. Cercetătorii și -au publicat rezultatele luna trecută pe serverul de preprint biorxiv 1.

Studiul expune „lipsa de cunoștințe” în ceea ce privește efectuarea unui control adecvat al calității plasmidelor în laborator, spune Hiroyuki Nakai, genetician la Universitatea de Sănătate și Știință din Oregon, care nu a fost implicat în lucrare. El a observat deja probleme cu plasmidele fabricate de laborator, dar a fost surprins de frecvența erorilor descoperite de studiu. Este probabil multe lucrări științifice care au fost publicate pentru care rezultatele nu sunt reproductibile din cauza erorilor în proiectarea plasmidelor, adaugă el.

Timpul pierdut

Plasmidele sunt instrumente populare în laboratoarele de biologie, ca bacterii, inclusiv organismul model utilizat pe scară largăEscherichia coli, care folosesc structuri pentru stocarea și schimbul de gene. Acest lucru înseamnă că biologii pot crea plasmide de proiectare care conțin diverse gene de interes, apoiE.coliConvinge -i să le înregistreze și să facă multe copii ale acestora.

Bruce Lahn, om de știință șef la VectorBuilder, o companie din Chicago, Illinois, care oferă instrumente de livrare a genelor, spune că el și alți biologi au observat probleme cu calitatea plasmidelor de ani buni. Când Lahn a fost profesor la Universitatea din Chicago, un student absolvent în laboratorul său a petrecut șase luni reproducând două plasmide care au fost raportate în literatura științifică. „Nu ne -am gândit la calitatea plasmidelor, dar atunci experimentul nu a funcționat”, deoarece plasmidele conțineau erori, spune el.

Acum, la VectorBuilder, Lahn spune că vede problema tot timpul - așa că a decis să o evalueze sistematic. Când clienții depun plasmide defectuoase, „pierd mult timp”, iar pașii suplimentari ai controlului calității cresc costul producerii plasmidelor și ambalarea lor în viruși, spune el.

Analiza echipei VectorBuilder a relevat un hodgepodge de erori în cele peste 2.500 de plasmide evaluate. Unele conțineau gene care codificau proteinele responsabileE.colierau toxice, ceea ce înseamnă că ar putea încetini sau opri creșterea organismelor pe care biologii se bazează pentru a -și reproduce plasmidele. Altele, destinate ambalajului în viruși, proteine ​​codificate care erau toxice pentru acei viruși. Iar unele conțineau secvențe de ADN repetitive care pot acumula mutații în plasmide.

Verificarea erorilor

Cele mai frecvente erori pe care Lahn și colegii săi au găsit -o au fost asociați cu un instrument cheie de terapie genică. Terapiile sunt adesea ambalate în virusuri asociate adeno (AAV), care sunt în mare parte inofensive și pot oferi tratamente celulelor. Atunci când creează plasmidele pentru aceste AAV, cercetătorii sandwich o genă terapeutică între secvențele numite ITRS, care joacă un rol critic în asigurarea genei este ambalată în virusul pentru livrare. Aceste secvențe trimit în esență un semnal biologic către celule care spune „Eu aparțin acestui virus”. Cu toate acestea, echipa a constatat că aproximativ 40% din plasmidele AAV din studiu au avut mutații în regiunile ITR care ar putea denatura acest mesaj important. Dacă cercetătorii ar folosi aceste plasmide greșite, terapia lor genică ar putea să nu funcționeze - și ar putea dura mult timp pentru ca oamenii de știință să -și dea seama de ce.

Mark Kay, un specialist pe pediatrie și genetică la Stanford School of Medicine din California, a văzut, de asemenea, de prima dată că erorile plasmidelor pot întârzia proiectele de laborator. Cu toate acestea, este încrezător că oamenii de știință pot identifica și corecta aceste erori. El spune că cercetătorii de terapie genică sunt conștienți de posibilele probleme ITR și că erorile sunt puțin probabile în setările clinice. Acest lucru se datorează faptului că agențiile de reglementare precum Administrația pentru Alimente și Droguri din SUA au standarde stricte care impun cercetătorilor să -și analizeze cu atenție plasmidele înainte de a le folosi în clinică.

Nakai spune că verificarea erorilor plasmidelor prin secvențiere ar putea avertiza cercetătorii cu privire la problemele evidențiate în studiu. Unele companii, inclusiv Plasmidsaurus din Eugene, Oregon și Elim Biofarmaceuticals din Hayward, California, oferă secvențiere plasmide pentru aproximativ 15,00 USD pe eșantion, spune Nakai, care nu are niciun interes financiar pentru nicio companie. De asemenea, recomandă ca noii membri ai laboratorului să petreacă timp învățând de la designeri cu plasmide cu experiență; Este un proces laborios, lucrat manual, spune el, dar dacă faceți o greșeală, poate pierde o cantitate extraordinară de timp și bani.

Un alt mod pentru laboratoare de a evita problemele este de a-și pune în funcțiune secvențele plasmidelor disponibile în depozite cu acces deschis, spune Melina Fan, ofițer științific șef la Nonprofit Addgene din Watertown, Massachusetts. Addgene oferă un astfel de depozit, spune Fan, și „secvențează plasmidele depuse și împărtășește datele secvenței prin intermediul site -ului pentru utilizarea comunității.” Verificarea plasmidelor este importantă, adaugă ea.

Lahn speră că analiza echipei sale atrage atenția cercetătorilor asupra faptului că aceste instrumente de laborator de lucru sunt adesea luate de la sine. „Sănătatea instrumentului este ceva la care oamenii nu se gândesc”, spune el, chiar dacă ar trebui.