Alvorlige feil pest DNA -verktøy som er et arbeidsdyr i biologi

Alvorlige feil pest DNA -verktøy som er et arbeidsdyr i biologi
Laboratory -laget plasmid, en arbeidshest i moderne biologi, har problemer. Forskere gjennomførte en systematisk evaluering av de sirkulære DNA -strukturene ved å analysere mer enn 2500 plasmider som ble produsert i laboratorier og sendt til et selskap som tilbyr tjenester som å pakke strukturene innen virus slik at de kan brukes som gendeltak. Teamet fant at nesten halvparten av plasmiddesignfeilene hadde, inkludert feil i sekvenser som er avgjørende for uttrykk for et terapeutisk gen. Forskerne publiserte resultatene sine forrige måned på preprint-serveren biorxiv
Studien avslører "mangel på kunnskap" om implementering av plasmider i laboratoriet, sier Hiroyuki Nakai, en genetiker ved Health & Science University i Oregon, som ikke var involvert i arbeidet. Han hadde allerede lagt merke til problemer med plasmider laget i laboratoriet, men ble overrasket over hyppigheten av feilene som er oppført av studien. Det er sannsynligvis mange vitenskapelige verk som er publisert som resultatene ikke er reproduserbare på grunn av feil i plasmiddesign, legger han til.
bortkastet tid
Plasmid er populære verktøy i biologilaboratorier, siden bakterier, inkludert den utbredte modellorganismen Escherichia coli , bruker strukturer for lagring og erstatning av gener. Dette betyr at biologer kan produsere designerplasmid som inneholder forskjellige interessante gener, og deretter e. Coli kan overtale dem til å registrere dem og lage mange eksemplarer av det.
Bruce Lahn, sjefforsker ved VectorBuilder, et selskap med base i Chicago, Illinois, gir genet leveringsverktøy, sier at han og andre biologer har lagt merke til problemer med plasmidkvalitet i årevis. Da Lahn var professor ved University of Chicago, tilbrakte en doktorgradsstudent seks måneder på laboratoriet sitt for å reprodusere to plasmid som var rapportert i vitenskapelig litteratur. "Vi tenkte ikke på kvaliteten på plasmid, men da fungerte ikke eksperimentet" fordi plasmidfeilene inneholdt, sier han.
Nå hos VectorBuilder sier Lahn at han stadig blir konfrontert med problemet - så han bestemte seg for å systematisk evaluere det. Når kunder sender inn feil plasmid, "de kaster bort mye tid", og de ekstra trinnene i kvalitetskontroll øker kostnadene for produksjon av plasmid og emballasjen deres i virus, sier han.
Analysen av VectorBuilder -teamet resulterte i et smorgasbord av feil i de mer enn 2500 rangerte plasmidene. Noen inneholdt gener som kodede proteiner, som for e. Coli var giftige, noe som betyr at de kunne bremse eller stoppe veksten av organismer, til biologene for å gjenskape plasmordene sine. Andre som var ment for emballasjen i virus kodede proteiner som var giftige for disse virusene. Og noen inneholdt repeterende DNA -sekvenser som kan akkumuleres i plasmidmutasjoner.
Gjennomgang av feil
De vanligste feilene som ble funnet Lahn og kollegene hans var koblet til et nøkkelverktøy for genterapi. Terapier er ofte pakket i adeno-assosierte virus (AAV-er), som stort sett er ufarlige og kan transportere behandlinger til celler. Når du produserer plasmidet for disse AAVS Sandwichen -forskere, er et terapeutisk gen mellom sekvensene som blir referert til som ITR -er og spiller en avgjørende rolle i å sikre at genet er pakket i viruset for levering. Disse sekvensene sender i hovedsak et biologisk signal av celler, som sier "Jeg tilhører dette viruset". Imidlertid fant teamet at omtrent 40% av AAV -plasmidtene i studien hadde mutasjoner i ITR -regionene som kunne forfalske denne viktige meldingen. Hvis forskere brukte dette feil designet plasmid, kunne ikke deres genterapi fungere-og det kan ta lang tid for forskerne å finne ut hvorfor.
Mark Kay, spesialist i pediatri og genetikk ved Stanford School of Medicine i California, har også sett først og fremst at plasmidfeil kan utsette laboratorieprosjekter. Han er imidlertid trygg på at forskere kan gjenkjenne og fikse disse feilene. Han sier at forskere av genterapi vet mulige ITR -problemer, og at feil i kliniske miljøer er usannsynlige. Dette er fordi regulerende myndigheter som US Food and Drug Administration har strenge standarder, forskerne forplikter seg til å analysere plasmordene sine nøye før de bruker dem på klinikken.
Nakai sier at gjennomgangen av plasmider for feil ved sekvensering kan trekke forskerne klar over problemene som ble vektlagt i studien. Noen selskaper, inkludert plasmidsaurus i Eugene, Oregon og Elim Biopharmaceuticals i Hayward, California, tilbyr plasmid -sekvensering for rundt $ 15,00 per prøve, sier Nakai, som ikke har noen økonomisk interesse i begge selskaper. Han anbefaler også at nye laboratoriearbeidere bruker tid på å lære av erfarne plasmiddesignere; Det er en kjedelig, manuell prosess, sier han, men hvis du gjør en feil, kan han kaste bort enorm tid og penger.
En annen måte for laboratorier å unngå problemer er å gjøre plasmidsekvensene dine i Open Access-depoter som er offentlig tilgjengelige, sier Melina Fan, vitenskapelig offiser for den ideelle organisasjonen Addgenene i Watertown, Massachusetts. Addgene tilbyr et slikt depot, sier fan, og "sekvenser det lagrede plasmidet og kommuniserer sekvensdataene via nettstedet for bruk av samfunnet". Det er viktig å sjekke plasmider.
Lahn håper at analysen av teamet hans retter forskernes oppmerksomhet til det faktum at disse arbeidsdyrlaboratorieverktøyene ofte tas for gitt. "Helsen til verktøyet er noe folk ikke tenker på," sier han, selv om de burde.