Ernstige fouten pest DNA -tool dat een werkdier is in de biologie

Laboratorium -gemaakt plasmide, een werkpaard in de moderne biologie, heeft problemen. Onderzoekers voerden een systematische evaluatie van de circulaire DNA -structuren uit door meer dan 2500 plasmiden te analyseren die in laboratoria werden geproduceerd en naar een bedrijf worden gestuurd dat diensten aanbiedt zoals het verpakken van de structuren binnen virussen zodat ze kunnen worden gebruikt als gentherapieën. Het team ontdekte dat bijna de helft van de plasmide -ontwerpfouten had, inclusief fouten in sequenties die cruciaal zijn voor de expressie van een therapeutisch gen. De onderzoekers publiceerden vorige maand hun resultaten op de preprint-server Biorxiv 1 .

De studie onthult "een gebrek aan kennis" over de implementatie van plasmiden in het laboratorium, zegt Hiroyuki Nakai, een geneticus aan de Health & Science University in Oregon, die niet betrokken was bij werk. Hij had al problemen opgemerkt met plasmiden die in het laboratorium waren gemaakt, maar was verrast door de frequentie van de fouten die door de studie werden vermeld. Er zijn waarschijnlijk veel wetenschappelijke werken die zijn gepubliceerd waarvoor de resultaten niet reproduceerbaar zijn vanwege fouten in het plasmide -ontwerp, voegt hij eraan toe.

verspilde tijd

plasmide zijn populaire hulpmiddelen in biologielaboratoria, omdat bacteriën, inclusief het wijdverbreide modelorganisme Escherichia coli , structuren gebruiken voor het opslaan en vervangen van genen. Dit betekent dat biologen designerplasmide kunnen produceren die verschillende interessante genen bevatten, en vervolgens e. Coli kan hen overtuigen om ze op te nemen en er veel kopieën van te maken.

Bruce Lahn, hoofdwetenschapper bij Vectorbuilder, een bedrijf gevestigd in Chicago, Illinois, biedt de genezingstools van Gene, zegt dat hij en andere biologen al jaren problemen met plasmide -kwaliteit hebben opgemerkt. Toen Lahn professor was aan de Universiteit van Chicago, bracht een doctoraatsstudent zes maanden in zijn laboratorium door om twee plasmide te reproduceren die in wetenschappelijke literatuur waren gemeld. "We hebben niet nagedacht over de kwaliteit van het plasmide, maar toen werkte het experiment niet" omdat de plasmide -fouten bevatten, zegt hij.

Nu bij VectorBuilder zegt Lahn dat hij constant met het probleem wordt geconfronteerd - dus besloot hij het systematisch te evalueren. Wanneer klanten defect plasmide indienen, "ze verspillen veel tijd", en de extra stappen in kwaliteitscontrole verhogen de kosten voor de productie van het plasmide en hun verpakking in virussen, zegt hij.

De analyse van het VectorBuilder -team resulteerde in een smorgasbord van fouten in de meer dan 2500 nominale plasmiden. Sommige bevatten genen die eiwitten gecodeerd, die voor e. Coli was giftig, wat betekent dat ze de groei van de organismen konden vertragen of stoppen, tot de biologen om hun plasmiden te repliceren. Anderen die bedoeld waren voor de verpakking in virussen gecodeerde eiwitten die giftig waren voor deze virussen. En sommige bevatten repetitieve DNA -sequenties die zich kunnen verzamelen in plasmide -mutaties.

beoordeling van fouten

De meest voorkomende fouten vonden Lahn en zijn collega's waren verbonden met een belangrijk hulpmiddel voor gentherapie. Therapieën worden vaak verpakt in adeno-geassocieerde virussen (AAV's), die grotendeels onschadelijk zijn en behandelingen in cellen kunnen vervoeren. Bij het produceren van het plasmide voor deze AAV's Sandwichen -onderzoekers, een therapeutisch gen tussen sequenties die worden genoemd als ITR's en een cruciale rol spelen om ervoor te zorgen dat het gen in het virus wordt verpakt voor levering. Deze sequenties sturen in wezen een biologisch signaal van cellen, dat zegt: "Ik behoor tot dit virus". Het team ontdekte echter dat ongeveer 40% van de AAV -plasmiden in de studie mutaties hadden in de ITR -regio's die deze belangrijke boodschap konden vervalsen. Als onderzoekers dit onjuist ontworpen plasmide gebruikten, zou hun gentherapie niet kunnen werken-en het kan lang duren voordat de wetenschappers erachter komen waarom.

Mark Kay, een specialist in kindergeneeskunde en genetica aan de Stanford School of Medicaly in Californië, heeft ook eerst gezien -de hand dat plasmide -fouten laboratoriumprojecten kunnen vertragen. Hij is er echter van overtuigd dat wetenschappers deze fouten kunnen herkennen en oplossen. Hij zegt dat onderzoekers van gentherapie mogelijke ITR -problemen kennen en dat fouten in klinische omgevingen onwaarschijnlijk zijn. Dit komt omdat regelgevende autoriteiten zoals de US Food and Drug Administration strikte normen hebben, de onderzoekers verplichten hun plasmiden zorgvuldig te analyseren voordat ze in de kliniek worden gebruikt.

Nakai zegt dat de beoordeling van plasmiden voor fouten door sequencing de onderzoekers bewust kan trekken van de problemen die in de studie zijn benadrukt. Sommige bedrijven, waaronder Plasmidsaurus in Eugene, Oregon en Elim Biopharmaceuticals in Hayward, Californië, bieden plasmide -sequencing voor ongeveer $ 15,00 per steekproef, zegt Nakai, die geen financieel belang heeft in beide bedrijven. Hij beveelt ook aan dat nieuwe laboratoriumwerkers tijd besteden aan het leren van ervaren plasmide -ontwerpers; Het is een vervelend, handmatig proces, zegt hij, maar als je een fout maakt, kan hij een enorme hoeveelheid tijd en geld verspillen.

Een andere manier voor laboratoria om problemen te voorkomen, is om uw plasmide-sequenties in open toegangsrepositories publiekelijk toegankelijk te maken, zegt Melina Fan, Chief Scientific Officer van de non-profit organisatie AddGenene in Watertown, Massachusetts. AddGene biedt een dergelijke repository, zegt Fan en "sequenties het opgeslagen plasmide en communiceert de sequentiegegevens via de website voor gebruik door de community". Het is belangrijk om plasmiden te controleren.

Lahn hoopt dat de analyse van zijn team de aandacht van de onderzoekers richt op het feit dat deze werkmiddelen voor dieren in het werk vaak als vanzelfsprekend worden beschouwd. "De gezondheid van de tool is iets waar mensen niet aan denken", zegt hij, ook al zouden ze moeten.