Laboratorijos inžinerinės plazmidės, šiuolaikinės biologijos darbo arklys, turi problemų. Tyrėjai atliko sistemingą žiedinių DNR struktūrų vertinimą analizuodami daugiau nei 2500 plazmidžių, pagamintų laboratorijose, ir siunčiamos į įmonę, teikiančią tokias paslaugas kaip virusų struktūrų pakavimas, kad jos būtų naudojamos kaip genų terapija. Komanda nustatė, kad beveik pusė plazmidžių turėjo projektavimo klaidų, įskaitant sekų klaidas, svarbias terapinio geno ekspresijai. Praėjusį mėnesį tyrėjai paskelbė savo rezultatus „PrePrint Server Biorxiv“ 1.

Tyrimas atskleidžia „žinių trūkumą“ apie tinkamą plazmidžių kokybės kontrolę laboratorijoje, sako Hiroyuki Nakai, Oregono sveikatos ir mokslo universiteto genetikas, kuris nedalyvavo darbe. Jis jau pastebėjo laboratorijų pagamintų plazmidžių problemas, tačiau jį nustebino tyrimo atskleistų klaidų dažnis. Tikėtina, kad yra daug mokslinių dokumentų, kurie buvo paskelbti, kurių rezultatai nėra atkuriami dėl klaidų plazmidės dizaine, priduria jis.

Iššvaistytas laikas

Plazmidės yra populiarios biologijos laboratorijose, kaip bakterijos, įskaitant plačiai naudojamą modelio organizmą, įskaitant plačiai naudojamą modelio organizmąEscherichia coli, kurios naudoja struktūras genams laikyti ir keistis. Tai reiškia, kad biologai gali sukurti dizainerių plazmides, kuriose yra įvairių dominančių genų, o paskui - tadaE.ColiĮtikinkite juos įrašyti juos ir padaryti daug jų kopijų.

Bruce'as Lahnas, Čikagos, Ilinojaus valstijos įmonės „VectorBuilder“ vyriausiasis mokslininkas, teikiantis genų pristatymo įrankius, sako, kad jis ir kiti biologai daugelį metų pastebėjo plazmidžių kokybės problemas. Kai Lahnas buvo Čikagos universiteto profesorius, jo laboratorijos magistrantas šešis mėnesius praleido dauginant dvi plazmides, apie kurias buvo pranešta mokslinėje literatūroje. „Mes negalvojome apie plazmidžių kokybę, bet tada eksperimentas neveikė“, nes plazmidėse buvo klaidų, sako jis.

Dabar „VectorBuilder“ Lahnas sako, kad visą laiką mato problemą - todėl nusprendė sistemingai ją įvertinti. Kai klientai pateikia sugedusias plazmides, „jie švaisto daug laiko“, o papildomi kokybės kontrolės žingsniai padidina plazmidžių gamybos sąnaudas ir supakuoja jas į virusus.

„VectorBuilder“ komandos analizė atskleidė daugybę klaidų daugiau nei 2500 įvertintų plazmidžių. Kai kuriuose buvo genų, kurie užkodavo baltymus, atsakingus užE.Colibuvo toksiški, tai reiškia, kad jie gali sulėtinti ar sustabdyti organizmų, kuriais remiasi biologai, augimą, kad atkartotų savo plazmides. Kiti, skirti pakuoti į virusus, užkoduoti baltymai, kurie buvo toksiški tiems virusams. O kai kuriose buvo pasikartojančios DNR sekos, kurios gali kaupti mutacijas plazmidėse.

Klaidų tikrinimas

Labiausiai paplitusios Lahno ir jo kolegų klaidos buvo susijusios su pagrindine genų terapijos įrankiu. Terapija dažnai supakuojama į adeno ir susijusius virusus (AAV), kurie dažniausiai yra nekenksmingi ir gali atlikti gydymą ląstelėms. Kurdami šių AAV plazmides, tyrėjai sumuša terapinį geną tarp sekų, vadinamų ITRS, kurie vaidina svarbų vaidmenį užtikrinant, kad genas būtų supakuotas į virusą, kad būtų galima pristatyti. Šios sekos iš esmės siunčia biologinį signalą ląstelėms, kurios sako: „Aš priklausau šiam virusui“. Tačiau komanda nustatė, kad apie 40% AAV plazmidžių tyrime buvo mutacijos ITR regionuose, kurie galėtų iškraipyti šią svarbią žinią. Jei tyrėjai panaudotų šias neteisingai nustatytas plazmides, jų genų terapija gali neveikti - ir mokslininkams gali prireikti daug laiko išsiaiškinti, kodėl.

Markas Kay, pediatrijos ir genetikos specialistas iš Stanfordo medicinos mokyklos Kalifornijoje, taip pat matė, kad plazmidžių klaidos gali atidėti laboratorinius projektus. Tačiau jis įsitikinęs, kad mokslininkai gali nustatyti ir ištaisyti šias klaidas. Jis sako, kad genų terapijos tyrėjai žino apie galimas ITR problemas ir kad klinikinės aplinkos klaidos yra mažai tikėtinos. Taip yra todėl, kad reguliavimo agentūros, tokios kaip JAV maisto ir vaistų administracija, turi griežtus standartus, dėl kurių tyrėjai reikalauja, kad prieš naudodama jas klinikoje atidžiai išanalizuotų savo plazmides.

Nakai sako, kad patikrinimas dėl klaidų, susijusių su sekomis, gali įspėti tyrėjus apie problemas, pabrėžtas tyrime. Kai kurios įmonės, įskaitant Plasmidsaurus Eugene, Oregone ir Elim Biofarmaceuticals Hayward mieste, Kalifornijoje, siūlo plazmidžių seką už maždaug 15,00 USD už imtį, sako Nakai, kuri neturi finansinio susidomėjimo nė viena įmone. Jis taip pat rekomenduoja naujiems laboratorijos nariams praleisti laiką mokydamiesi iš patyrusių plazmidžių dizainerių; Jis sako, kad tai daug darbo, rankomis parengtas procesas, tačiau jei padarysite klaidą, tai gali švaistyti didžiulį laiko ir pinigų kiekį.

Kitas būdas laboratorijoms išvengti problemų yra padaryti jų plazmidžių sekas viešai prieinamas atviros prieigos saugyklose, sako Melina Fan, ne pelno siekiančios „Addgene“, Masačusetso valstijoje, vyriausioji mokslinė pareigūnė. „Addgene“ pateikia tokią saugyklą, sako „Fan“, ir „seka nusodintų plazmidžių ir dalijasi sekos duomenimis per svetainę bendruomenės naudojimui“. Svarbu tikrinti plazmides, priduria ji.

Lahnas tikisi, kad jo komandos analizė atkreipia tyrėjų dėmesį į tai, kad šios „Workhorse Lab“ įrankiai dažnai laikomi savaime suprantamu dalyku. „Į įrankio sveikata yra tai, apie ką žmonės negalvoja“, - sako jis, net jei jie turėtų.