I plasmidi ingegnerizzati in laboratorio, cavallo di battaglia della biologia moderna, hanno problemi. I ricercatori hanno condotto una valutazione sistematica delle strutture circolari del DNA analizzando più di 2.500 plasmidi realizzati in laboratorio e inviati a un'azienda che fornisce servizi come il confezionamento delle strutture all'interno dei virus in modo che possano essere utilizzati come terapie geniche. Il team ha scoperto che quasi la metà dei plasmidi presentava errori di progettazione, compresi errori nelle sequenze critiche per l'espressione di un gene terapeutico. I ricercatori hanno pubblicato i loro risultati il ​​mese scorso sul server di prestampa bioRxiv 1.

Lo studio evidenzia "una mancanza di conoscenza" sulla conduzione di un adeguato controllo di qualità dei plasmidi in laboratorio, afferma Hiroyuki Nakai, un genetista della Health & Science University in Oregon che non è stato coinvolto nel lavoro. Aveva già notato problemi con i plasmidi prodotti in laboratorio, ma è rimasto sorpreso dalla frequenza degli errori scoperti dallo studio. Probabilmente sono stati pubblicati molti articoli scientifici i cui risultati non sono riproducibili a causa di errori nella progettazione del plasmide, aggiunge.

Tempo sprecato

I plasmidi sono strumenti popolari nei laboratori di biologia, come i batteri, compreso l'organismo modello ampiamente utilizzatoEscherichia coli, che utilizzano strutture per immagazzinare e scambiare geni. Ciò significa che i biologi possono creare plasmidi progettati che contengono vari geni di interesse, e poiE.coliconvinceteli a registrarli e a farne molte copie.

Bruce Lahn, capo scienziato di VectorBuilder, una società con sede a Chicago, Illinois, che fornisce strumenti per la distribuzione dei geni, afferma che lui e altri biologi hanno notato da anni problemi con la qualità dei plasmidi. Quando Lahn era professore all'Università di Chicago, uno studente laureato nel suo laboratorio trascorse sei mesi a riprodurre due plasmidi che erano stati riportati nella letteratura scientifica. “Non abbiamo pensato alla qualità dei plasmidi, ma poi l'esperimento non ha funzionato” perché i plasmidi contenevano errori, dice.

Ora in VectorBuilder, Lahn afferma di vedere il problema continuamente, quindi ha deciso di valutarlo sistematicamente. Quando i clienti inviano plasmidi difettosi, "perdono molto tempo" e i passaggi aggiuntivi nel controllo di qualità aumentano il costo di produzione dei plasmidi e del loro confezionamento in virus, afferma.

L'analisi del team di VectorBuilder ha rivelato un miscuglio di errori negli oltre 2.500 plasmidi valutati. Alcuni contenevano geni che codificavano per le proteine ​​responsabiliE.colierano tossici, nel senso che potevano rallentare o fermare la crescita degli organismi su cui i biologi fanno affidamento per replicare i loro plasmidi. Altri, destinati al confezionamento di virus, codificavano proteine ​​tossiche per quei virus. E alcuni contenevano sequenze di DNA ripetitive che possono accumulare mutazioni nei plasmidi.

Controllo degli errori

Gli errori più comuni riscontrati da Lahn e dai suoi colleghi erano collegati a uno strumento chiave di terapia genica. Le terapie sono spesso racchiuse in virus adeno-associati (AAV), che sono per lo più innocui e possono fornire trattamenti alle cellule. Quando creano i plasmidi per questi AAV, i ricercatori inseriscono un gene terapeutico tra sequenze chiamate ITR, che svolgono un ruolo fondamentale nel garantire che il gene venga confezionato nel virus per la consegna. Queste sequenze essenzialmente inviano un segnale biologico alle cellule che dice “Io appartengo a questo virus”. Tuttavia, il team ha scoperto che circa il 40% dei plasmidi AAV nello studio presentavano mutazioni nelle regioni ITR che potevano distorcere questo importante messaggio. Se i ricercatori utilizzassero questi plasmidi mal progettati, la loro terapia genica potrebbe non funzionare e gli scienziati potrebbero impiegare molto tempo per capirne il motivo.

Anche Mark Kay, specialista in pediatria e genetica presso la Stanford School of Medicine in California, ha visto in prima persona che gli errori dei plasmidi possono ritardare i progetti di laboratorio. Tuttavia, è fiducioso che gli scienziati possano identificare e correggere questi errori. Dice che i ricercatori di terapia genica sono consapevoli dei possibili problemi di ITR e che gli errori sono improbabili in contesti clinici. Questo perché le agenzie di regolamentazione come la Food and Drug Administration statunitense hanno standard rigorosi che richiedono ai ricercatori di analizzare attentamente i loro plasmidi prima di utilizzarli in clinica.

Nakai afferma che il controllo degli errori dei plasmidi attraverso il sequenziamento potrebbe allertare i ricercatori sui problemi evidenziati nello studio. Alcune aziende, tra cui Plasmidsaurus a Eugene, Oregon, e Elim Biopharmaceuticals a Hayward, California, offrono il sequenziamento dei plasmidi per circa $ 15,00 per campione, afferma Nakai, che non ha interessi finanziari in nessuna delle due società. Raccomanda inoltre ai nuovi membri del laboratorio di trascorrere del tempo imparando da progettisti di plasmidi esperti; È un processo laborioso e artigianale, afferma, ma se si commette un errore si può sprecare un'enorme quantità di tempo e denaro.

Un altro modo con cui i laboratori possono evitare problemi è rendere le loro sequenze plasmidiche disponibili al pubblico in archivi ad accesso aperto, afferma Melina Fan, direttore scientifico presso l'organizzazione no-profit Addgene a Watertown, Massachusetts. Addgene fornisce un archivio di questo tipo, afferma Fan, e "sequenzia i plasmidi depositati e condivide i dati della sequenza attraverso il sito Web per l'uso da parte della comunità". Controllare i plasmidi è importante, aggiunge.

Lahn spera che l'analisi del suo team attiri l'attenzione dei ricercatori sul fatto che questi strumenti di laboratorio sono spesso dati per scontati. “La salute dello strumento è qualcosa a cui le persone non pensano”, dice, anche se dovrebbero.