Laboratory -Plasmide fatto, un cavallo da lavoro in biologia moderna, ha problemi. I ricercatori hanno effettuato una valutazione sistematica delle strutture circolari del DNA analizzando più di 2.500 plasmidi che sono stati prodotti nei laboratori e inviati a un'azienda che offre servizi come il packaging delle strutture all'interno dei virus in modo che possano essere utilizzati come terapie geniche. Il team ha scoperto che quasi la metà degli errori di progettazione del plasmide, inclusi errori in sequenze che sono cruciali per l'espressione di un gene terapeutico. I ricercatori hanno pubblicato i loro risultati il ​​mese scorso sul server preprint biorxiv 1 .

Lo studio rivela "una mancanza di conoscenza" sull'attuazione dei plasmidi in laboratorio, afferma Hiroyuki Nakai, genetista presso la Health & Science University in Oregon, che non era coinvolto nel lavoro. Aveva già notato problemi con i plasmidi fatti in laboratorio, ma era sorpreso dalla frequenza degli errori elencati dallo studio. Probabilmente ci sono molte opere scientifiche che sono state pubblicate per le quali i risultati non sono riproducibili a causa di errori nella progettazione di plasmide, aggiunge.

tempo sprecato

Plasmide sono strumenti popolari nei laboratori di biologia, poiché i batteri, incluso il diffuso organismo modello Escherichia coli , usano strutture per conservare e sostituire i geni. Ciò significa che i biologi possono produrre plasmide di design che contengono vari geni interessanti e poi e. Coli può convincerli a registrarli e farne molte copie.

Bruce Lahn, capo scienziato di Vectorbuilder, una società con sede a Chicago, Illinois, fornisce gli strumenti di consegna genica, afferma che lui e altri biologi hanno notato per anni problemi con la qualità del plasmide. Quando Lahn era professore all'Università di Chicago, uno studente di dottorato ha trascorso sei mesi nel suo laboratorio per riprodurre due plasmide che erano stati segnalati nella letteratura scientifica. "Non abbiamo pensato alla qualità del plasmide, ma poi l'esperimento non ha funzionato" perché gli errori del plasmide contenevano, dice.

Ora a Vectorbuilder Lahn afferma di essere costantemente di fronte al problema, quindi ha deciso di valutarlo sistematicamente. Quando i clienti presentano un plasmide difettoso, "sprecano molto tempo" e i passaggi aggiuntivi per il controllo di qualità aumentano i costi per la produzione del plasmide e il loro imballaggio in virus, afferma.

L'analisi del team VectorBuilder ha comportato una smorgasbord di errori negli oltre 2.500 plasmidi nominati. Alcuni contenevano geni che codificavano le proteine, che per e. Coli erano velenosi, il che significa che potevano rallentare o fermare la crescita degli organismi, ai biologi per replicare i loro plasmidi. Altri che erano destinati all'imballaggio in virus codificate proteine ​​che erano velenose per questi virus. E alcuni contenevano sequenze ripetitive di DNA che possono accumularsi nelle mutazioni del plasmide.

revisione degli errori

Gli errori più comuni hanno scoperto che Lahn e i suoi colleghi erano collegati a uno strumento chiave per la terapia genica. Le terapie sono spesso confezionate in virus adeno-associati (AAV), che sono in gran parte innocui e possono trasportare trattamenti in cellule. Quando si produce il plasmide per questi ricercatori di AAVS Sandwich, un gene terapeutico tra sequenze che vengono indicati come ITR e svolgono un ruolo cruciale nel garantire che il gene sia pieno nel virus per la consegna. Queste sequenze inviano essenzialmente un segnale biologico di cellule, che dice "Appartengo a questo virus". Tuttavia, il team ha scoperto che circa il 40% dei plasmidi AAV nello studio aveva mutazioni nelle regioni ITR che potevano falsificare questo importante messaggio. Se i ricercatori utilizzassero questo plasmide progettato in modo errato, la loro terapia genica non potrebbe funzionare e potrebbe volerci molto tempo per gli scienziati per scoprire perché.

Mark Kay, specialista in pediatria e genetica presso la Stanford School of Medicine in California, ha anche visto in primo luogo che i faglie di plasmide possono ritardare i progetti di laboratorio. Tuttavia, è fiducioso che gli scienziati possano riconoscere e correggere questi errori. Dice che i ricercatori della terapia genica conoscono possibili problemi ITR e che sono improbabili errori in ambienti clinici. Questo perché le autorità di regolamentazione come la Food and Drug Administration degli Stati Uniti hanno standard rigorosi, i ricercatori si obbligano ad analizzare attentamente i loro plasmidi prima di usarli in clinica.

Nakai afferma che la revisione dei plasmidi per gli errori del sequenziamento potrebbe attirare i ricercatori consapevoli dei problemi enfatizzati nello studio. Alcune aziende, tra cui Plasmidsaurus a Eugene, Oregon, ed Elim Biofarmaceuticals a Hayward, in California, offrono sequenziamento plasmide per circa $ 15,00 per campione, afferma Nakai, che non ha interesse finanziario in entrambe le società. Raccomanda inoltre ai nuovi lavoratori di laboratorio di trascorrere del tempo a imparare da progettisti di plasmidi esperti; È un processo noioso e manuale, dice, ma se commetti un errore, può sprecare un'enorme quantità di tempo e denaro.

Un altro modo per i laboratori di evitare problemi è quello di rendere pubblicamente accessibili le sequenze di plasmidi in repository ad accesso aperto, afferma Melina Fan, Chief Scientific Officer dell'organizzazione no profit Addgenene a Watertown, nel Massachusetts. Addgene offre un tale repository, afferma Fan e "Sequenze il plasmide memorizzato e comunica i dati di sequenza tramite il sito Web da utilizzare da parte della comunità". È importante controllare i plasmidi.

Lahn spera che l'analisi del suo team dirige l'attenzione dei ricercatori sul fatto che questi strumenti di laboratorio di animali lavorano spesso per scontati. "La salute dello strumento è qualcosa a cui le persone non pensano", dice, anche se dovrebbero.