Laboratorijski izrađeni plazmidi, radna konja moderne biologije, imaju problema. Istraživači su proveli sustavnu procjenu kružnih struktura DNK analizirajući više od 2500 plazmida napravljenih u laboratorijima i poslali tvrtki koja pruža usluge poput pakiranja struktura unutar virusa kako bi se mogle koristiti kao genska terapija. Tim je otkrio da gotovo polovica plazmida ima pogreške u dizajnu, uključujući pogreške u nizovima kritičnim za ekspresiju terapijskog gena. Istraživači su prošli mjesec objavili svoje rezultate na preprint poslužitelju Biorxiv 1.

Studija izlaže "nedostatak znanja" o provođenju odgovarajuće kontrole kvalitete plazmida u laboratoriju, kaže Hiroyuki Nakai, genetičar sa Sveučilišta Health & Science u Oregonu koji nije bio uključen u posao. Već je primijetio probleme s laboratorijskim plazmidima, ali bio je iznenađen učestalošću pogrešaka koje je studija otkrila. Vjerojatno postoje mnogi znanstveni radovi koji su objavljeni za koje se rezultati ne mogu ponoviti zbog pogrešaka u dizajnu plazmida, dodaje.

Izgubljeno vrijeme

Plazmidi su popularni alati u biološkim laboratorijima, kao bakterije, uključujući široko korišteni model organizmaEscherichia coli, koje koriste strukture za pohranu i razmjenu gena. To znači da biolozi mogu stvoriti dizajnerske plazmide koji sadrže različite gene koji su od interesa, a zatimE.coliUvjerite ih da ih zabilježe i naprave mnogo njihovih primjeraka.

Bruce Lahn, glavni znanstvenik iz VectorBuilder-a, tvrtka sa sjedištem u Chicagu, Illinoisu koja pruža alate za isporuku gena, kaže da su on i drugi biolozi već godinama primjećivali probleme s kvalitetom plazmida. Kad je Lahn bio profesor na Sveučilištu u Chicagu, diplomski student u svom laboratoriju proveo je šest mjeseci reproducirajući dva plazmida koji su prijavljeni u znanstvenoj literaturi. "Nismo razmišljali o kvaliteti plazmida, ali tada eksperiment nije uspio", jer plazmidi sadrže pogreške, kaže on.

Sada u VectorBuilderu, Lahn kaže da problem stalno vidi problem - pa ga je odlučio sustavno procijeniti. Kad kupci predaju neispravne plazmide, "troše puno vremena", a dodatni koraci u kontroli kvalitete povećavaju troškove proizvodnje plazmida i pakiranja u viruse, kaže on.

Analiza tima VectorBuilder otkrila je da je ocijenjena pogreškama u više od 2500 plazmida. Neki su sadržavali gene koji su kodirali proteine ​​odgovorne zaE.colibili su toksični, što znači da mogu usporiti ili zaustaviti rast organizama na koje se biolozi oslanjaju kako bi replicirali svoje plazmide. Drugi, namijenjeni pakiranju u viruse, kodirani proteini koji su bili toksični za one viruse. A neki su sadržavali ponavljajuće sekvence DNA koje mogu akumulirati mutacije u plazmidima.

Pogreške u provjeri

Najčešće pogreške koje su pronađene Lahn i njegovi kolege povezane su s ključnim alatom za gensku terapiju. Terapije se često pakiraju u adeno-povezane viruse (AAV), koji su uglavnom bezopasni i mogu isporučiti tretmane stanicama. Prilikom stvaranja plazmida za ove AAV -ove, istraživači sendviču terapijski gen između nizova zvanih ITRS, koji igraju kritičnu ulogu u osiguravanju da se gen spakira u virus za isporuku. Ove sekvence u osnovi šalju biološki signal stanicama koje piše "Pripadam ovom virusu." Međutim, tim je otkrio da oko 40% AAV plazmida u studiji ima mutacije u ITR regijama koje bi mogle izostaviti ovu važnu poruku. Ako su istraživači koristili ove pogrešne plazmide, njihova genska terapija možda neće uspjeti - i moglo bi potrajati znanstvenici da shvate zašto.

Mark Kay, specijalist za pedijatriju i genetiku na Stanford School of Medicine u Kaliforniji, također je iz prve ruke vidio da pogreške plazmida mogu odgoditi laboratorijske projekte. Međutim, uvjeren je da znanstvenici mogu prepoznati i ispraviti te pogreške. Kaže da su istraživači genske terapije svjesni mogućih problema s ITR -om i da su pogreške malo vjerojatne u kliničkim okruženjima. To je zato što regulatorne agencije poput američke Uprave za hranu i lijekove imaju stroge standarde koji zahtijevaju da istraživači pažljivo analiziraju svoje plazmide prije nego što ih koriste u klinici.

Nakai kaže da bi provjera plazmida za pogreške kroz sekvenciranje mogla upozoriti istraživače na probleme istaknute u studiji. Neke tvrtke, uključujući plazmidsaurus u Eugeneu, Oregon, i Elime Biopharmaceuticals u Haywardu u Kaliforniji, nude sekvenciranje plazmida za oko 15,00 USD po uzorku, kaže Nakai, koji nema financijski interes ni u jednoj tvrtki. Također preporučuje da novi članovi laboratorija provode vrijeme učeći od iskusnih dizajnera plazmida; To je naporan, ručno izrađen proces, kaže on, ali ako pogriješite, to može izgubiti ogromnu količinu vremena i novca.

Drugi način da laboratoriji izbjegavaju probleme je da se njihovi plazmidni nizovi javno dostupne u spremištima otvorenog pristupa, kaže Melina Fan, glavna znanstvena službenica u neprofitnoj addgene u Watertownu, Massachusetts. Addgene pruža takvo spremište, kaže navijač i "slijedi deponirane plazmide i dijeli podatke o sekvenci putem web stranice za upotrebu zajednice." Provjera plazmida je važno, dodaje ona.

Lahn se nada da je analiza njegovog tima skrenula pažnju istraživača na činjenicu da se ovi alati za laboratoriju radnog konja često uzimaju zdravo za gotovo. "Zdravlje alata je nešto o čemu ljudi ne razmišljaju", kaže on, iako bi trebali.