Ozbiljne pogreške Kuga DNK alat koji je radna životinja u biologiji
Ozbiljne pogreške Kuga DNK alat koji je radna životinja u biologiji
Laboratorij -izrađen plazmid, radni konj u modernoj biologiji, ima problema. Istraživači su proveli sustavnu procjenu kružnih struktura DNK analizirajući više od 2500 plazmida koji su proizvedeni u laboratorijama i poslani tvrtki koja nudi usluge poput pakiranja struktura unutar virusa kako bi se mogle koristiti kao genske terapije. Tim je otkrio da je imala gotovo polovica pogrešaka u dizajnu plazmida, uključujući pogreške u nizovima koje su ključne za ekspresiju terapijskog gena. Istraživači su prošli mjesec objavili svoje rezultate na preprint poslužitelju Biorxiv
Studija otkriva "nedostatak znanja" o provedbi plazmida u laboratoriju, kaže Hiroyuki Nakai, genetičar sa Sveučilišta Health & Science u Oregonu, koji nije bio uključen u posao. Već je primijetio probleme s plazmidima napravljenim u laboratoriju, ali iznenadio ga je učestalost pogrešaka koje je studija navela. Vjerojatno postoji puno znanstvenih djela koja su objavljena za koja se rezultati ne mogu ponoviti zbog pogrešaka u dizajnu plazmida, dodaje.
izgubljeno vrijeme
plazmid su popularni alati u biološkim laboratorijama, budući da bakterije, uključujući široko rasprostranjeni model organizma escherichia coli, koriste strukture za skladištenje i zamjenu gena. To znači da biolozi mogu proizvesti dizajnerski plazmid koji sadrži razne zanimljive gene, a zatim e. Coli ih može uvjeriti da ih snimaju i naprave mnoge kopije.
Bruce Lahn, glavni znanstvenik iz VectorBuilder -a, tvrtke sa sjedištem u Chicagu, Illinois, pruža alate za isporuku gena, kaže da su on i drugi biolozi već godinama primjećivali probleme s kvalitetom plazmida. Kad je Lahn bio profesor na Sveučilištu u Chicagu, doktorski student proveo je šest mjeseci u svom laboratoriju kako bi reproducirao dva plazmida koji su prijavljeni u znanstvenoj literaturi. "Nismo razmišljali o kvaliteti plazmida, ali tada eksperiment nije funkcionirao", jer su pogreške u plazmidu sadržavale, kaže on.
Sada u VectorBuilder Lahn kaže da se stalno suočava s problemom - pa ga je odlučio sustavno procijeniti. Kad kupci predaju neispravan plazmid, "troše puno vremena", a dodatni koraci u kontroli kvalitete povećavaju troškove za proizvodnju plazmida i njihovo pakiranje u virusima, kaže on.
Analiza tima VectorBuilder rezultirala je smorgasbordom pogrešaka u više od 2500 ocijenjenih plazmida. Neki su sadržavali gene koji su kodirali proteine, koji su za e. Coli su bili otrovni, što znači da bi mogli usporiti ili zaustaviti rast organizama, biolozima da repliciraju svoje plazmide. Ostali koji su bili namijenjeni pakiranju u virusima kodiranim proteinima koji su bili otrovni za ove viruse. A neki su sadržavali ponavljajuće sekvence DNK koje se mogu akumulirati u mutacijama plazmida.
Pregled pogrešaka
Najčešće pogreške koje su pronašle Lahn i njegove kolege bile su povezane s ključnim alatom za gensku terapiju. Terapije se često spakiraju u viruse povezane s adeno (AAV), koji su uglavnom bezopasni i mogu prevesti tretmane u stanice. Prilikom izrade plazmida za ove istraživače AAVS sendviču, terapeutski gen između sekvenci koji se nazivaju IRS -om i igraju ključnu ulogu u osiguravanju da se gen spakira u virus za isporuku. Ove sekvence u osnovi šalju biološki signal stanica, koji kaže "Ja pripadam ovom virusu". Međutim, tim je utvrdio da oko 40% AAV plazmida u studiji ima mutacije u ITR regijama koje bi mogle krivotvoriti ovu važnu poruku. Ako su istraživači koristili ovaj pogrešno dizajnirani plazmid, njihova genska terapija ne bi mogla raditi-a znanstvenici bi mogli potrajati dugo vremena da saznaju zašto.
Mark Kay, specijalist za pedijatriju i genetiku na Medicinskom fakultetu u Stanfordu u Kaliforniji, također je prvi put vidio da plazmidske greške mogu odgoditi laboratorijske projekte. Međutim, uvjeren je da znanstvenici mogu prepoznati i popraviti ove pogreške. Kaže da istraživači genske terapije znaju moguće probleme s ITR -om i da pogreške u kliničkom okruženju nisu vjerojatne. To je zato što regulatorna tijela poput američke Uprave za hranu i lijekove imaju stroge standarde, istraživači se obvezuju pažljivo analizirati svoje plazmide prije nego što ih koriste u klinici.
Nakai kaže da bi pregled plazmida za pogreške sekvenciranjem mogao privući istraživače svjesne problema naglašenih u studiji. Neke tvrtke, uključujući plazmidsaurus u Eugeneu, Oregon, i Elime Biopharmaceuticals u Haywardu u Kaliforniji, nude sekvenciranje plazmida za oko 15,00 USD po uzorku, kaže Nakai, koji nema financijski interes za obje tvrtke. Također preporučuje da novi laboratorijski radnici provode vrijeme učeći od iskusnih dizajnera plazmida; To je zamoran, ručni postupak, kaže, ali ako pogriješite, može izgubiti ogromnu količinu vremena i novca.
Drugi način da laboratoriji izbjegavaju probleme je da vaše plazmidne sekvence u spremištima otvorenog pristupa budu javno dostupne, kaže Melina Fan, glavna znanstvena službenica neprofitne organizacije Addgenene u Watertownu, Massachusetts. Addgene nudi takvo spremište, kaže navijač i "sekvenci pohranjeni plazmid i komunicira podatke o sekvenci putem web stranice za upotrebu od strane zajednice". Važno je provjeriti plazmide.
Lahn se nada da će analiza njegovog tima usmjeriti pažnju istraživača na činjenicu da se ti laboratorijski alati za životinje često uzimaju zdravo za gotovo. "Zdravlje alata je nešto o čemu ljudi ne razmišljaju", kaže on, iako bi trebali.
-
bai, x. i sur. preprint na biorxiv https://doi.org/10.1101/2024.06.17.596931 .