Laboratoorseteks plasmiidides, moodsa bioloogia tööhobusel, on probleeme. Teadlased viisid läbi ümmarguste DNA struktuuride süstemaatilise hindamise, analüüsides enam kui 2500 laborites valmistatud plasmiidi ja saadeti ettevõttele, mis pakub selliseid teenuseid, näiteks viiruste struktuuride pakendamine, et neid saaks kasutada geeniteraapiana. Meeskond leidis, et peaaegu pooltel plasmiididest olid kujundusvead, sealhulgas vead järjestustes, mis on kriitilised terapeutilise geeni ekspressiooni jaoks. Teadlased avaldasid eelmisel kuul oma tulemused Preprint Server Biorxivist 1.

Uuring paljastab "teadmiste puudumise" laboris plasmiidide korraliku kvaliteedikontrolli läbiviimise kohta, ütles Oregoni tervise- ja teadusülikooli geneetik Hiroyuki Nakai, kes ei olnud tööga seotud. Ta oli juba märganud probleeme labori valmistatud plasmiididega, kuid oli üllatunud uuringust avaldatud vigade sageduse üle. Tõenäoliselt on avaldatud palju teaduslikke pabereid, mille tulemused ei ole plasmiidide kujundamise vigade tõttu reprodutseeritavad, lisab ta.

Raisatud aeg

Plasmiidid on populaarsed tööriistad bioloogialaborites, nagu bakterid, sealhulgas laialt kasutatav mudelorganismEscherichia coli, mis kasutavad geenide hoidmiseks ja vahetamiseks struktuure. See tähendab, et bioloogid saavad luua disaineri plasmiide, mis sisaldavad erinevaid huvipakkuvaid geene, ja seejärelE.koliVeenda neid neid salvestama ja tegema neist palju koopiaid.

Chicagos asuva Illinoisis asuva ettevõtte VectorBuilderi peateadur Bruce Lahn, mis pakub geenide kohaletoimetamise tööriistu, ütleb, et tema ja teised bioloogid on aastaid märganud probleeme plasmiidi kvaliteediga. Kui Lahn oli Chicago ülikooli professor, veetis oma labori kraadiõppur kuus kuud, reprodutseerides kahte plasmiidi, millest teaduslikus kirjanduses teatati. "Me ei mõelnud plasmiidide kvaliteedile, kuid siis katse ei töötanud", kuna plasmiidid sisaldasid vigu, ütleb ta.

Nüüd VectorBuilderis ütleb Lahn, et näeb probleemi kogu aeg - nii otsustas ta seda süstemaatiliselt hinnata. Kui kliendid esitavad vigaseid plasmiide, "raiskavad nad palju aega" ja kvaliteedikontrolli täiendavad sammud suurendavad plasmiidide tootmise ja viirustesse pakendamise kulusid, ütles ta.

VectorBuilderi meeskonna analüüs näitas, et hinnati enam kui 2500 plasmiidi vigu. Mõned sisaldasid geene, mis kodeerisid vastutavaid valkeE.koliolid mürgised, mis tähendab, et nad võivad aeglustada või peatada nende organismide kasvu, millele bioloogid oma plasmiide ​​reprodutseerivad. Teised, kes olid mõeldud viirustesse pakendamiseks, kodeeriti nende viiruste jaoks mürgiseid valke. Ja mõned sisaldasid korduvaid DNA järjestusi, mis võivad mutatsioone koguda plasmiidides.

Vigade kontrollimine

Kõige tavalisemad vead, mida Lahn ja tema kolleegid leiti, olid seotud võtmegeeniteraapia tööriistaga. Ravi pakitakse sageli adeno-assotsieerunud viirustesse (AAV-desse), mis on enamasti kahjutud ja võivad rakkudesse töödelda. Nendele AAV -dele plasmiidide loomisel võidavad teadlased terapeutilise geeni järjestuste vahel, mida nimetatakse ITR -deks, millel on kriitiline roll geen pakitud viirusesse kohaletoimetamiseks. Need järjestused saadavad põhimõtteliselt bioloogilise signaali rakkudele, mis ütlevad: "Ma kuulun sellesse viirusse". Kuid meeskond leidis, et umbes 40% -l uuringus osalenud AAV -plasmiididest olid mutatsioonid ITR piirkondades, mis võivad seda olulist sõnumit moonutada. Kui teadlased kasutasid neid väärkasutatud plasmiide, ei pruugi nende geeniteraapia toimida - ja teadlastel võib kuluda kaua aega, miks.

Californias Stanfordi meditsiinikooli laste- ja geneetika spetsialist Mark Kay on samuti näinud, et plasmiidivead võivad laboriprojekte edasi lükata. Siiski on ta kindel, et teadlased saavad neid vigu tuvastada ja parandada. Ta ütleb, et geeniteraapia teadlased on teadlikud võimalike ITR -i probleemidest ja et vead on kliinilises keskkonnas ebatõenäolised. Selle põhjuseks on asjaolu, et reguleerivatel asutustel, nagu USA toidu- ja ravimiamet, on ranged standardid, mis nõuavad teadlastelt enne kliinikus kasutamist oma plasmiide ​​hoolikalt analüüsimist.

Nakai ütleb, et plasmiidide kontrollimine vigade sekveneerimise kaudu võib teadlasi hoiatada uuringus esile toodud probleemide eest. Mõned ettevõtted, sealhulgas PlasmiDsaurus Eugene'is, Oregonis, ja Californias Haywardis asuv Elim Biopharmaceuticals pakuvad plasmiidide järjestamist umbes 15,00 dollari eest proovi kohta, ütles Nakai, kellel pole kummaski ettevõttes rahalist huvi. Samuti soovitab ta uutel laboriliikmetel veeta aega kogenud plasmiidide disaineritelt; Tema sõnul on see vaevarikas, käsitsi meisterdatud protsess, kuid kui teete vea, võib see raisata tohutult aega ja raha.

Teine viis laborite probleemide vältimiseks on muuta nende plasmiidsed järjestused avalikult kättesaadavaks avatud juurdepääsu hoidlates, ütles Massachusettsi osariigis Watertownis asuva mittetulundusühingu Addgene teadusjuht Melina Fan. Addgene pakub sellist hoidlat, väidab Fan, ja see "järjestab deponeeritud plasmiidid ja jagab järjestuse andmeid veebisaidi kaudu kogukonna kasutamiseks." Plasmiidide kontrollimine on oluline, lisab ta.

Lahn loodab, et tema meeskonna analüüs juhib teadlaste tähelepanu tõsiasjale, et neid tööhobuselabori tööriistu peetakse sageli enesestmõistetavaks. "Tööriista tervis on asi, millele inimesed ei mõtle," ütleb ta, kuigi nad peaksid.