Errores graves Herramienta de ADN de peste que es un animal de trabajo en biología
Errores graves Herramienta de ADN de peste que es un animal de trabajo en biología
El plásmido hecho de laboratorio, un caballo de trabajo en biología moderna, tiene problemas. Los investigadores llevaron a cabo una evaluación sistemática de las estructuras de ADN circulares mediante el análisis de más de 2.500 plásmidos que se produjeron en laboratorios y se enviaron a una compañía que ofrece servicios como empacar las estructuras dentro de los virus para que puedan usarse como terapias génicas. El equipo descubrió que casi la mitad de los errores de diseño de plásmido tenían, incluidos errores en secuencias que son cruciales para la expresión de un gen terapéutico. Los investigadores publicaron sus resultados el mes pasado en el servidor Preprint BiorXiv <1P> 1 .
El estudio revela "falta de conocimiento" sobre la implementación de plásmidos en el laboratorio, dice Hiroyuki Nakai, genetista de la Universidad de Salud y Ciencias en Oregón, que no participó en el trabajo. Ya había notado problemas con los plásmidos hechos en el laboratorio, pero se sorprendió por la frecuencia de los errores enumerados por el estudio. Probablemente hay muchos trabajos científicos que se han publicado para los cuales los resultados no son reproducibles debido a errores en el diseño de plásmidos, agrega.
tiempo perdido
El plásmido son herramientas populares en laboratorios de biología, ya que las bacterias, incluido el organismo modelo generalizado Escherichia coli , usan estructuras para almacenar y reemplazar genes. Esto significa que los biólogos pueden producir plasmuro de diseño que contienen varios genes interesantes, y luego e. Coli puede persuadirlos para que los graben y hagan muchas copias.
Bruce Lahn, científico jefe de VectorBuilder, una compañía con sede en Chicago, Illinois, proporciona las herramientas de entrega de genes, dice que él y otros biólogos han notado problemas con la calidad del plásmido durante años. Cuando Lahn era profesor en la Universidad de Chicago, un estudiante de doctorado pasó seis meses en su laboratorio para reproducir dos plásmidos que habían sido reportados en la literatura científica. "No pensamos en la calidad del plásmido, pero luego el experimento no funcionó" porque los errores de plásmido contenían, dice.
Ahora en VectorBuilder Lahn dice que se enfrenta constantemente al problema, por lo que decidió evaluarlo sistemáticamente. Cuando los clientes presentan plásmido defectuoso, "pierden mucho tiempo", y los pasos adicionales en el control de calidad aumentan los costos para la producción del plasmuro y su embalaje en virus, dice.
El análisis del equipo VectorBuilder dio como resultado una mezcla heterogénea de errores en los más de 2.500 plásmidos calificados. Algunos contenían genes que codificaron proteínas, que para e. Coli fue venenoso, lo que significa que podrían reducir la velocidad o detener el crecimiento de los organismos, a los biólogos para replicar sus plásmidos. Otros que estaban destinados al embalaje en virus codificaron proteínas que eran venenosas para estos virus. Y algunos contenían secuencias de ADN repetitivas que pueden acumularse en mutaciones plásmidas.
Revisión de errores
Los errores más comunes encontraron que Lahn y sus colegas estaban conectados a una herramienta clave para la terapia génica. Las terapias a menudo se empacan en virus adenoasociados (AAV), que son en gran medida inofensivos y pueden transportar tratamientos a las células. Al producir el plásmido para estos investigadores de AAVS Sandwichen, un gen terapéutico entre secuencias que se conocen como ITR y juegan un papel crucial para garantizar que el gen esté empaquetado en el virus para su entrega. Estas secuencias esencialmente envían una señal biológica de células, que dice "Pertenezco a este virus". Sin embargo, el equipo encontró que alrededor del 40% de los plásmidos AAV en el estudio tenían mutaciones en las regiones de ITR que podían falsificar este importante mensaje. Si los investigadores utilizaron este plásmido de diseño incorrecto, su terapia génica no podría funcionar, y los científicos pueden tardar mucho tiempo en descubrir por qué.
Mark Kay, especialista en pediatría y genética en la Escuela de Medicina de Stanford en California, también ha visto de primera mano que las fallas del plásmido pueden retrasar los proyectos de laboratorio. Sin embargo, confía en que los científicos pueden reconocer y corregir estos errores. Él dice que los investigadores de terapia génica conocen posibles problemas de ITR y que los errores en entornos clínicos son poco probables. Esto se debe a que las autoridades reguladoras como la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos tienen estándares estrictos, los investigadores obligan a analizar cuidadosamente sus plásmidos antes de usarlos en la clínica.
Nakai dice que la revisión de los plásmidos para los errores por secuenciación podría atraer a los investigadores conscientes de los problemas enfatizados en el estudio. Algunas compañías, incluido Plasmidsaurus en Eugene, Oregon, y eliminan los biofarmacéuticos en Hayward, California, ofrecen secuenciación de plásmidos por aproximadamente $ 15.00 por muestra, dice Nakai, que no tiene interés financiero en ambas compañías. También recomienda que los nuevos trabajadores de laboratorio pasen tiempo aprendiendo de diseñadores de plásmidos experimentados; Es un proceso manual tedioso, dice, pero si comete un error, puede desperdiciar una enorme cantidad de tiempo y dinero.
Otra forma para que los laboratorios eviten problemas es hacer que sus secuencias de plásmido en repositorios de acceso abierto accesibles públicamente, dice Melina Fan, directora científica de la organización sin fines de lucro Addgenene en Watertown, Massachusetts. AddGene ofrece dicho repositorio, dice Fan, y "secuencia el plasmuro almacenado y comunica los datos de secuencia a través del sitio web para su uso de la comunidad". Es importante verificar los plásmidos.
Lahn espera que el análisis de su equipo dirija la atención de los investigadores sobre el hecho de que estos trabajos a menudo se dan por sentado las herramientas de laboratorio de animales. "La salud de la herramienta es algo en lo que la gente no piensa", dice, aunque deberían hacerlo.
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bai, x. et al. Preimpresión en biorxiv >>>>>>>>>> https://doi.org/10.1101/2024.06.17.596931 .