Σοβαρές λάθη πλήττουν το εργαλείο DNA που είναι ένα ζώο εργασίας στη βιολογία

Σοβαρές λάθη πλήττουν το εργαλείο DNA που είναι ένα ζώο εργασίας στη βιολογία
Εργαστήριο -Το πλασμίδιο, ένα άλογο εργασίας στη σύγχρονη βιολογία, έχει προβλήματα. Οι ερευνητές πραγματοποίησαν συστηματική αξιολόγηση των κυκλικών δομών DNA αναλύοντας περισσότερα από 2.500 πλασμίδια που παράγονται σε εργαστήρια και αποστέλλονται σε μια εταιρεία που προσφέρει υπηρεσίες όπως η συσκευασία των δομών στους ιούς έτσι ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γονιδιακές θεραπείες. Η ομάδα διαπίστωσε ότι σχεδόν το ήμισυ των σφαλμάτων σχεδιασμού πλασμιδίου είχαν, συμπεριλαμβανομένων των σφαλμάτων σε αλληλουχίες που είναι ζωτικής σημασίας για την έκφραση ενός θεραπευτικού γονιδίου. Οι ερευνητές δημοσίευσαν τα αποτελέσματά τους τον περασμένο μήνα στο Preprint Server Biorxiv Η μελέτη αποκαλύπτει "έλλειψη γνώσης" σχετικά με την εφαρμογή πλασμιδίων στο εργαστήριο, λέει ο Hiroyuki Nakai, γενετιστής στο Πανεπιστήμιο Health & Science στο Όρεγκον, ο οποίος δεν συμμετείχε στην εργασία. Είχε ήδη παρατηρήσει προβλήματα με τα πλασμίδια που έγιναν στο εργαστήριο, αλλά εκπλήσσονταν από τη συχνότητα των λαθών που απαριθμούνται από τη μελέτη. Υπάρχουν πιθανώς πολλά επιστημονικά έργα που έχουν δημοσιευθεί για τα οποία τα αποτελέσματα δεν είναι αναπαραγώγιμα λόγω σφαλμάτων στο σχεδιασμό πλασμιδίου, προσθέτει. πλασμίδιο είναι δημοφιλή εργαλεία στα εργαστήρια βιολογίας, καθώς τα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένου του ευρέως διαδεδομένου μοντέλου οργανισμού Escherichia coli , χρησιμοποιούν δομές για την αποθήκευση και την αντικατάσταση των γονιδίων. Αυτό σημαίνει ότι οι βιολόγοι μπορούν να παράγουν πλασμίδιο σχεδιαστών που περιέχουν διάφορα ενδιαφέροντα γονίδια και στη συνέχεια e. Το Coli μπορεί να τους πείσει να τα καταγράψουν και να κάνουν πολλά αντίγραφα του. Ο Bruce Lahn, επικεφαλής επιστήμονας στο VectorBuilder, μια εταιρεία που εδρεύει στο Σικάγο του Ιλλινόις, παρέχει τα εργαλεία παράδοσης γονιδίων, λέει ότι αυτός και άλλοι βιολόγοι έχουν παρατηρήσει προβλήματα με την ποιότητα του πλασμιδίου εδώ και χρόνια. Όταν ο Lahn ήταν καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο, ένας διδακτορικός φοιτητής πέρασε έξι μήνες στο εργαστήριό του για να αναπαράγει δύο πλασμίδιο που είχε αναφερθεί στην επιστημονική βιβλιογραφία. "Δεν σκεφτήκαμε την ποιότητα του πλασμιδίου, αλλά τότε το πείραμα δεν λειτούργησε" επειδή τα σφάλματα πλασμιδίου περιέχονται, λέει. Τώρα στο VectorBuilder Lahn λέει ότι αντιμετωπίζει συνεχώς το πρόβλημα - έτσι αποφάσισε να το αξιολογήσει συστηματικά. Όταν οι πελάτες υποβάλλουν ελαττωματικό πλασμίδιο, "σπαταλούν πολύ χρόνο" και τα πρόσθετα βήματα στον έλεγχο ποιότητας αυξάνουν το κόστος για την παραγωγή του πλασμιδίου και τη συσκευασία τους σε ιούς, λέει. Η ανάλυση της ομάδας VectorBuilder είχε ως αποτέλεσμα ένα smorgasbord σφαλμάτων στα περισσότερα από 2.500 ονομαστικά πλασμίδια. Ορισμένα περιείχαν γονίδια που κωδικοποιούσαν πρωτεΐνες, τα οποία για e. Οι Coli ήταν δηλητηριώδεις, πράγμα που σημαίνει ότι θα μπορούσαν να επιβραδύνουν ή να σταματήσουν την ανάπτυξη των οργανισμών, στους βιολόγους να αναπαράγουν τα πλασμίδια τους. Άλλοι που προορίζονταν για τη συσκευασία σε ιούς κωδικοποιημένες πρωτεΐνες που ήταν δηλητηριώδεις για αυτούς τους ιούς. Και μερικές περιείχαν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που μπορούν να συσσωρευτούν σε μεταλλάξεις πλασμιδίων. Τα πιο συνηθισμένα λάθη βρήκαν ότι ο Lahn και οι συνάδελφοί του συνδέονταν με ένα βασικό εργαλείο για τη γονιδιακή θεραπεία. Οι θεραπείες είναι συχνά συσκευασμένες σε ιούς που σχετίζονται με αδενο (AAVs), οι οποίοι είναι σε μεγάλο βαθμό αβλαβείς και μπορούν να μεταφέρουν θεραπείες σε κύτταρα. Κατά την παραγωγή του πλασμιδίου για αυτούς τους ερευνητές Sandwichen AAV, ένα θεραπευτικό γονίδιο μεταξύ αλληλουχιών που αναφέρονται ως ITRs και διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην εξασφάλιση ότι το γονίδιο είναι γεμάτο στον ιό για παράδοση. Αυτές οι αλληλουχίες ουσιαστικά στέλνουν ένα βιολογικό σήμα των κυττάρων, το οποίο λέει "ανήκω σε αυτόν τον ιό". Ωστόσο, η ομάδα διαπίστωσε ότι περίπου το 40% των πλασμίδων AAV στη μελέτη είχε μεταλλάξεις στις περιοχές ITR που θα μπορούσαν να παραποιήσουν αυτό το σημαντικό μήνυμα. Εάν οι ερευνητές χρησιμοποίησαν αυτό το λανθασμένα σχεδιασμένο πλασμίδιο, η γονιδιακή τους θεραπεία δεν θα μπορούσε να λειτουργήσει και θα μπορούσε να χρειαστεί πολύς χρόνος για τους επιστήμονες να μάθουν γιατί. Ο Mark Kay, ειδικός στην παιδιατρική και τη γενετική στη Σχολή Ιατρικής του Στάνφορντ στην Καλιφόρνια, έχει επίσης δει πρώτα ότι τα πλασμίδια σφάλματα μπορούν να καθυστερήσουν τα εργαστηριακά έργα. Ωστόσο, είναι σίγουρος ότι οι επιστήμονες μπορούν να αναγνωρίσουν και να διορθώσουν αυτά τα λάθη. Λέει ότι οι ερευνητές της γονιδιακής θεραπείας γνωρίζουν πιθανές προβλημάτων ITR και ότι τα λάθη σε κλινικά περιβάλλοντα είναι απίθανο. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι ρυθμιστικές αρχές όπως η αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων έχουν αυστηρά πρότυπα, οι ερευνητές υποχρεώνουν να αναλύουν προσεκτικά τα πλασμίδια τους πριν τα χρησιμοποιήσουν στην κλινική. Ο Nakai λέει ότι η ανασκόπηση των πλασμιδίων για σφάλματα με προσδιορισμό αλληλουχίας θα μπορούσε να προσελκύσει τους ερευνητές να γνωρίζουν τα προβλήματα που υπογραμμίστηκαν στη μελέτη. Ορισμένες εταιρείες, συμπεριλαμβανομένου του Plasmidsaurus στο Eugene, το Oregon και το Elim Biopharmaceuticals στο Hayward της Καλιφόρνια, προσφέρουν πλασμιδική αλληλουχία για περίπου 15,00 δολάρια ανά δείγμα, λέει ο Nakai, ο οποίος δεν έχει οικονομικό ενδιαφέρον και στις δύο εταιρείες. Συνιστά επίσης στους νέους εργαστηριακούς εργάτες να ξοδεύουν χρόνο μαθαίνοντας από έμπειρους σχεδιαστές πλασμιδίων. Είναι μια κουραστική, χειροκίνητη διαδικασία, λέει, αλλά αν κάνετε λάθος, μπορεί να χάσει ένα τεράστιο χρονικό διάστημα και χρήμα. Ένας άλλος τρόπος για τα εργαστήρια να αποφύγετε προβλήματα είναι να κάνετε τις αλληλουχίες πλασμιδίων σας σε αποθετήρια ανοικτής πρόσβασης προσβάσιμα δημοσίως, λέει η Melina Fan, επικεφαλής επιστημονικός υπάλληλος του μη κερδοσκοπικού οργανισμού Addgenene στο Watertown της Μασαχουσέτης. Το Addgene προσφέρει ένα τέτοιο αποθετήριο, λέει ο ανεμιστήρας και "ακολουθίες το αποθηκευμένο πλασμίδιο και επικοινωνεί τα δεδομένα αλληλουχίας μέσω του ιστότοπου για χρήση από την κοινότητα". Είναι σημαντικό να ελέγξετε τα πλασμίδια. Ο Lahn ελπίζει ότι η ανάλυση της ομάδας του κατευθύνει την προσοχή των ερευνητών στο γεγονός ότι αυτά τα εργαλεία εργαστηριακών εργασιών των ζώων συχνά θεωρούνται δεδομένο. "Η υγεία του εργαλείου είναι κάτι που οι άνθρωποι δεν σκέφτονται", λέει, παρόλο που πρέπει. Χρόνος απώλειας
Ανασκόπηση σφαλμάτων
- >
bai, x. et al. preprint on biorxiv > https://doi.org/10.1101/2024.06.17.596931 .