Τα πλασμίδια με μηχανική εργαστηριακής μηχανής, ένας εργάτης της σύγχρονης βιολογίας, έχουν προβλήματα. Οι ερευνητές διεξήγαγαν συστηματική αξιολόγηση των κυκλικών δομών DNA αναλύοντας περισσότερα από 2.500 πλασμίδια που κατασκευάζονται σε εργαστήρια και αποστέλλονται σε μια εταιρεία που παρέχει υπηρεσίες όπως η συσκευασία των δομών εντός των ιών, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γονιδιακές θεραπείες. Η ομάδα διαπίστωσε ότι σχεδόν το ήμισυ των πλασμιδίων είχαν σφάλματα σχεδιασμού, συμπεριλαμβανομένων των σφαλμάτων σε αλληλουχίες κρίσιμες για την έκφραση ενός θεραπευτικού γονιδίου. Οι ερευνητές δημοσίευσαν τα αποτελέσματά τους τον περασμένο μήνα στο Biorxiv του Preprint Server 1.

Η μελέτη εκθέτει "έλλειψη γνώσης" σχετικά με τη διεξαγωγή κατάλληλου ποιοτικού ελέγχου των πλασμιδίων στο εργαστήριο, λέει ο Hiroyuki Nakai, γενετιστής στο Πανεπιστήμιο Health & Science στο Όρεγκον που δεν συμμετείχε στο έργο. Είχε ήδη παρατηρήσει προβλήματα με εργαστηριακά πλασμίδια, αλλά εκπλήσσει τη συχνότητα των σφαλμάτων που αποκαλύφθηκαν από τη μελέτη. Υπάρχουν πιθανώς πολλά επιστημονικά έγγραφα που έχουν δημοσιευθεί για τα οποία τα αποτελέσματα δεν είναι αναπαραγώγιμα λόγω σφαλμάτων στο σχεδιασμό πλασμιδίου, προσθέτει.

Χρόνος σπατάλης

Τα πλασμίδια είναι δημοφιλή εργαλεία στα εργαστήρια βιολογίας, ως βακτήρια, συμπεριλαμβανομένου του ευρέως χρησιμοποιούμενου οργανισμού μοντέλουEscherichia coli, που χρησιμοποιούν δομές για την αποθήκευση και την ανταλλαγή γονιδίων. Αυτό σημαίνει ότι οι βιολόγοι μπορούν να δημιουργήσουν πλασμίδια σχεδιαστών που περιέχουν διάφορα γονίδια ενδιαφέροντος και στη συνέχειαE.coliΤους πείστε να καταγράψουν αυτά και να κάνουν πολλά αντίγραφα τους.

Ο Bruce Lahn, επικεφαλής επιστήμονας στο VectorBuilder, μια εταιρεία που εδρεύει στο Σικάγο, το Ιλλινόις, η οποία παρέχει εργαλεία παράδοσης γονιδίων, λέει ότι αυτός και άλλοι βιολόγοι έχουν παρατηρήσει προβλήματα με την ποιότητα του πλασμιδίου εδώ και χρόνια. Όταν ο Lahn ήταν καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο, ένας μεταπτυχιακός φοιτητής στο εργαστήριό του πέρασε έξι μήνες αναπαράγοντας δύο πλασμίδια που είχαν αναφερθεί στην επιστημονική βιβλιογραφία. "Δεν σκεφτήκαμε την ποιότητα των πλασμιδίων, αλλά τότε το πείραμα δεν λειτούργησε" επειδή τα πλασμίδια περιείχαν σφάλματα, λέει.

Τώρα στο VectorBuilder, ο Lahn λέει ότι βλέπει το πρόβλημα όλη την ώρα - έτσι αποφάσισε να το αξιολογήσει συστηματικά. Όταν οι πελάτες υποβάλλουν ελαττωματικά πλασμίδια, «σπαταλούν πολύ χρόνο» και τα επιπλέον βήματα στον έλεγχο ποιότητας αυξάνουν το κόστος παραγωγής των πλασμιδίων και τη συσκευασία τους σε ιούς, λέει.

Η ανάλυση της ομάδας VectorBuilder αποκάλυψε ένα hodgepodge με σφάλματα στα περισσότερα από 2.500 πλασμίδια που αξιολογήθηκαν. Μερικά περιείχαν γονίδια που κωδικοποιούσαν πρωτεΐνες υπεύθυνες γιαE.coliήταν τοξικές, δηλαδή θα μπορούσαν να επιβραδύνουν ή να σταματήσουν την ανάπτυξη των οργανισμών που οι βιολόγοι βασίζονται για να αναπαράγουν τα πλασμίδια τους. Άλλοι, που προορίζονται για συσκευασία σε ιούς, κωδικοποιημένες πρωτεΐνες που ήταν τοξικές για αυτούς τους ιούς. Και μερικές περιείχαν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που μπορούν να συσσωρεύουν μεταλλάξεις σε πλασμίδια.

Έλεγχος σφαλμάτων

Τα πιο συνηθισμένα σφάλματα Lahn και οι συνάδελφοί του που βρέθηκαν συνδέονταν με ένα βασικό εργαλείο γονιδιακής θεραπείας. Οι θεραπείες είναι συχνά συσκευασμένες σε ιούς που σχετίζονται με αδενο (AAVs), οι οποίοι είναι ως επί το πλείστον αβλαβείς και μπορούν να προσφέρουν θεραπείες στα κύτταρα. Κατά τη δημιουργία των πλασμιδίων για αυτά τα AAVs, οι ερευνητές σάντουιτς ένα θεραπευτικό γονίδιο μεταξύ των αλληλουχιών που ονομάζονται ITRs, οι οποίοι διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξασφάλιση ότι το γονίδιο είναι συσκευασμένο στον ιό για παράδοση. Αυτές οι αλληλουχίες ουσιαστικά στέλνουν ένα βιολογικό σήμα σε κύτταρα που λέει "ανήκω σε αυτόν τον ιό". Ωστόσο, η ομάδα διαπίστωσε ότι περίπου το 40% των πλασμιδίων AAV στη μελέτη είχαν μεταλλάξεις στις περιοχές ITR που θα μπορούσαν να στρεβλώσουν αυτό το σημαντικό μήνυμα. Εάν οι ερευνητές χρησιμοποίησαν αυτά τα λανθασμένα πλασμίδια, η γονιδιακή τους θεραπεία μπορεί να μην λειτουργεί - και θα μπορούσε να χρειαστεί πολύς χρόνος για τους επιστήμονες να καταλάβουν γιατί.

Ο Mark Kay, ειδικός παιδιατρικής και γενετικής στη Σχολή Ιατρικής του Στάνφορντ στην Καλιφόρνια, έχει επίσης δει από πρώτο χέρι ότι τα πλασμίδια σφάλματα μπορούν να καθυστερήσουν τα εργαστηριακά έργα. Ωστόσο, είναι σίγουρος ότι οι επιστήμονες μπορούν να εντοπίσουν και να διορθώσουν αυτά τα σφάλματα. Λέει ότι οι ερευνητές της γονιδιακής θεραπείας γνωρίζουν πιθανά προβλήματα ITR και ότι τα σφάλματα είναι απίθανο σε κλινικά περιβάλλοντα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι ρυθμιστικές υπηρεσίες όπως η αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων έχουν αυστηρά πρότυπα που απαιτούν από τους ερευνητές να αναλύουν προσεκτικά τα πλασμίδια τους πριν τα χρησιμοποιήσουν στην κλινική.

Ο Nakai λέει ότι ο έλεγχος των πλασμιδίων για σφάλματα μέσω της αλληλουχίας θα μπορούσε να προειδοποιήσει τους ερευνητές στα προβλήματα που επισημάνθηκαν στη μελέτη. Ορισμένες εταιρείες, συμπεριλαμβανομένου του Plasmidsaurus στο Eugene, το Oregon και το Elim Biopharmaceuticals στο Hayward της Καλιφόρνια, προσφέρουν την αλληλουχία πλασμιδίων για περίπου 15,00 δολάρια ανά δείγμα, λέει ο Nakai, ο οποίος δεν έχει οικονομικό ενδιαφέρον σε καμία εταιρεία. Συνιστά επίσης ότι τα νέα μέλη του εργαστηρίου ξοδεύουν χρόνο μαθαίνοντας από έμπειρους σχεδιαστές πλασμιδίων. Είναι μια επίπονη, χειροποίητη διαδικασία, λέει, αλλά αν κάνετε ένα λάθος μπορεί να χάσει ένα τεράστιο χρονικό διάστημα και χρήμα.

Ένας άλλος τρόπος για τα εργαστήρια να αποφεύγουν τα προβλήματα είναι να καταστήσουν τις αλληλουχίες πλασμιδίων τους διαθέσιμες στο κοινό σε αποθετήρια ανοικτής πρόσβασης, λέει η Melina Fan, επικεφαλής επιστημονικός υπάλληλος στο μη κερδοσκοπικό Addgene στο Watertown της Μασαχουσέτης. Το Addgene παρέχει ένα τέτοιο αποθετήριο, λέει ο ανεμιστήρας και "ακολουθεί τα κατατεθείσα πλασμίδια και μοιράζεται τα δεδομένα αλληλουχίας μέσω του ιστότοπου για κοινοτική χρήση". Ο έλεγχος των πλασμιδίων είναι σημαντικός, προσθέτει.

Ο Lahn ελπίζει ότι η ανάλυση της ομάδας του προσελκύει την προσοχή των ερευνητών στο γεγονός ότι αυτά τα εργαλεία εργαστηρίου εργασίας συχνά θεωρούνται δεδομένο. "Η υγεία του εργαλείου είναι κάτι που οι άνθρωποι δεν σκέφτονται", λέει, παρόλο που πρέπει.