Laboratorieudviklede plasmider, en arbejdshest i moderne biologi, har problemer. Forskere gennemførte en systematisk vurdering af cirkulære DNA-strukturer ved at analysere mere end 2.500 plasmider fremstillet i laboratorier og sendt til en virksomhed, der leverer tjenester såsom at pakke strukturerne i vira, så de kan bruges som genterapi. Holdet fandt ud af, at næsten halvdelen af ​​plasmiderne havde designfejl, herunder fejl i sekvenser, der er kritiske for ekspressionen af ​​et terapeutisk gen. Forskerne offentliggjorde deres resultater i sidste måned på preprint-serveren bioRxiv 1.

Undersøgelsen afslører "mangel på viden" om at udføre ordentlig kvalitetskontrol af plasmider i laboratoriet, siger Hiroyuki Nakai, en genetiker ved Health & Science University i Oregon, som ikke var involveret i arbejdet. Han havde allerede bemærket problemer med laboratoriefremstillede plasmider, men blev overrasket over hyppigheden af ​​fejl, som undersøgelsen afslørede. Der er sandsynligvis mange videnskabelige artikler, der er blevet offentliggjort, for hvilke resultaterne ikke er reproducerbare på grund af fejl i plasmiddesignet, tilføjer han.

Spildte tid

Plasmider er populære værktøjer i biologiske laboratorier, som bakterier, herunder den meget anvendte modelorganismeEscherichia coli, som bruger strukturer til at lagre og udveksle gener. Det betyder, at biologer kan skabe designerplasmider, der indeholder forskellige gener af interesse, og derefterE.coliovertale dem til at optage disse og lave mange kopier af dem.

Bruce Lahn, chefforsker hos VectorBuilder, et firma i Chicago, Illinois, der leverer værktøjer til genlevering, siger, at han og andre biologer har bemærket problemer med plasmidkvaliteten i årevis. Da Lahn var professor ved University of Chicago, brugte en kandidatstuderende i sit laboratorium seks måneder på at reproducere to plasmider, der var blevet rapporteret i den videnskabelige litteratur. "Vi tænkte ikke på kvaliteten af ​​plasmiderne, men så virkede eksperimentet ikke", fordi plasmiderne indeholdt fejl, siger han.

Nu hos VectorBuilder siger Lahn, at han ser problemet hele tiden - så han besluttede sig for systematisk at evaluere det. Når kunder indsender defekte plasmider, "spilder de en masse tid", og de ekstra trin i kvalitetskontrol øger omkostningerne ved at producere plasmiderne og pakke dem til vira, siger han.

VectorBuilder-teamets analyse afslørede en mængde fejl i de mere end 2.500 evaluerede plasmider. Nogle indeholdt gener, der kodede for proteiner, der var ansvarlige forE.colivar giftige, hvilket betyder, at de kunne bremse eller stoppe væksten af ​​de organismer, som biologer er afhængige af for at replikere deres plasmider. Andre, beregnet til emballering i vira, kodede proteiner, der var giftige for disse vira. Og nogle indeholdt gentagne DNA-sekvenser, der kan akkumulere mutationer i plasmider.

Kontrol af fejl

De mest almindelige fejl, Lahn og hans kolleger fandt, var knyttet til et nøgleværktøj til genterapi. Terapi er ofte pakket i adeno-associerede vira (AAV'er), som for det meste er harmløse og kan levere behandlinger til celler. Når forskerne opretter plasmiderne til disse AAV'er, placerer forskerne et terapeutisk gen mellem sekvenser kaldet ITR'er, som spiller en afgørende rolle i at sikre, at genet pakkes ind i virussen til levering. Disse sekvenser sender i det væsentlige et biologisk signal til celler, der siger "Jeg hører til i denne virus." Holdet fandt dog, at omkring 40% af AAV-plasmiderne i undersøgelsen havde mutationer i ITR-regionerne, der kunne forvrænge denne vigtige besked. Hvis forskere brugte disse fejldesignede plasmider, virker deres genterapi muligvis ikke - og det kan tage lang tid for forskere at finde ud af hvorfor.

Mark Kay, en pædiatrisk og genetikspecialist ved Stanford School of Medicine i Californien, har også selv set, at plasmidfejl kan forsinke laboratorieprojekter. Han er dog overbevist om, at videnskabsmænd kan identificere og rette disse fejl. Han siger, at genterapiforskere er opmærksomme på mulige ITR-problemer, og at fejl er usandsynlige i kliniske omgivelser. Det skyldes, at regulatoriske agenturer som US Food and Drug Administration har strenge standarder, der kræver, at forskere omhyggeligt analyserer deres plasmider, før de bruges i klinikken.

Nakai siger, at kontrol af plasmider for fejl gennem sekventering kunne advare forskere om de problemer, der er fremhævet i undersøgelsen. Nogle virksomheder, herunder Plasmidsaurus i Eugene, Oregon og Elim Biopharmaceuticals i Hayward, Californien, tilbyder plasmidsekvensering for omkring $15,00 pr. prøve, siger Nakai, som ikke har nogen økonomisk interesse i nogen af ​​selskaberne. Han anbefaler også, at nye laboratoriemedlemmer bruger tid på at lære af erfarne plasmiddesignere; Det er en besværlig, håndlavet proces, siger han, men hvis du laver en fejl, kan det spilde enormt meget tid og penge.

En anden måde, hvorpå laboratorier kan undgå problemer, er at gøre deres plasmidsekvenser offentligt tilgængelige i open-access-depoter, siger Melina Fan, chief scientific officer hos nonprofitorganisationen Addgene i Watertown, Massachusetts. Addgene leverer sådan et depot, siger Fan, og det "sekventerer de deponerede plasmider og deler sekvensdataene gennem webstedet til brug for fællesskabet." Det er vigtigt at tjekke plasmider, tilføjer hun.

Lahn håber, at hans teams analyse henleder forskernes opmærksomhed på, at disse laboratorieværktøjer til arbejdshest ofte tages for givet. "Værktøjets sundhed er noget, folk ikke tænker over," siger han, selvom de burde.