Alvorlige fejlspiller Pest -DNA -værktøj, der er et arbejdsdyr i biologi

Laboratorie -fremstillet plasmid, en arbejdshest i moderne biologi, har problemer. Forskere udførte en systematisk evaluering af de cirkulære DNA -strukturer ved at analysere mere end 2.500 plasmider, der blev produceret i laboratorier og sendt til et firma, der tilbyder tjenester såsom emballering af strukturer inden for vira, så de kan bruges som genterapier. Holdet fandt, at næsten halvdelen af ​​plasmiddesignfejlene havde, inklusive fejl i sekvenser, der er afgørende for ekspressionen af ​​et terapeutisk gen. Forskerne offentliggjorde deres resultater i sidste måned på Preprint Server Biorxiv 1 .

Undersøgelsen afslører "en mangel på viden" om implementering af plasmider i laboratoriet, siger Hiroyuki Nakai, en genetiker ved Health & Science University i Oregon, der ikke var involveret i arbejde. Han havde allerede bemærket problemer med plasmider lavet i laboratoriet, men blev overrasket over hyppigheden af ​​de fejl, der er anført af undersøgelsen. Der er sandsynligvis mange videnskabelige værker, der er blevet offentliggjort, som resultaterne ikke er reproducerbare på grund af fejl i plasmiddesign, tilføjer han.

spildt tid

Plasmid er populære værktøjer i biologilaboratorier, da bakterier, herunder den udbredte modelorganisme Escherichia coli , bruger strukturer til opbevaring og udskiftning af gener. Dette betyder, at biologer kan producere designerplasmid, der indeholder forskellige interessante gener, og derefter e. Coli kan overtale dem til at optage dem og lave mange kopier af det.

Bruce Lahn, chefforsker hos VectorBuilder, en virksomhed med base i Chicago, Illinois, leverer genleveringsværktøjer, siger, at han og andre biologer har bemærket problemer med plasmidkvalitet i årevis. Da Lahn var professor ved University of Chicago, tilbragte en doktorgradstudent seks måneder i sit laboratorium for at gengive to plasmid, der var rapporteret i videnskabelig litteratur. "Vi tænkte ikke på kvaliteten af ​​plasmidet, men så fungerede eksperimentet ikke", fordi plasmidfejlene indeholdt, siger han.

nu på VectorBuilder siger Lahn, at han konstant konfronteres med problemet - så han besluttede at systematisk evaluere det. Når kunder indsender defekte plasmid, "spilder de meget tid", og de yderligere trin i kvalitetskontrol øger omkostningerne til produktion af plasmidet og deres emballage i vira, siger han.

Analysen af ​​VectorBuilder -teamet resulterede i et smorgasbord med fejl i de mere end 2.500 nominelle plasmider. Nogle indeholdt gener, der kodede proteiner, som for e. Coli var giftige, hvilket betyder, at de kunne bremse eller stoppe væksten af ​​organismerne, til biologerne for at gentage deres plasmider. Andre, der var beregnet til emballagen i vira, kodede proteiner, der var giftige for disse vira. Og nogle indeholdt gentagne DNA -sekvenser, der kan akkumuleres i plasmidmutationer.

Gennemgang af fejl

De mest almindelige fejl fandt, at Lahn og hans kolleger var forbundet til et nøgleværktøj til genterapi. Terapier er ofte pakket i adeno-associerede vira (AAV'er), som stort set er ufarlige og kan transportere behandlinger til celler. Når man producerer plasmidet til disse AAVS -sandwichen -forskere, er et terapeutisk gen mellem sekvenser, der omtales som ITR'er, og spiller en afgørende rolle i at sikre, at genet er pakket i virussen til levering. Disse sekvenser sender i det væsentlige et biologisk signal af celler, der siger "Jeg hører til denne virus". Imidlertid fandt teamet, at ca. 40% af AAV -plasmiderne i undersøgelsen havde mutationer i ITR -regionerne, der kunne forfalskes denne vigtige meddelelse. Hvis forskere brugte dette forkert designede plasmid, kunne deres genterapi ikke arbejde-og det kunne tage lang tid for forskerne at finde ud af hvorfor.

Mark Kay, en specialist inden for pædiatri og genetik ved Stanford School of Medicine i Californien, har også set først -hånd, at plasmidfejl kan forsinke laboratorieprojekter. Han er dog overbevist om, at forskere kan genkende og løse disse fejl. Han siger, at forskere i genterapi ved mulige ITR -problemer, og at fejl i kliniske miljøer er usandsynlige. Dette skyldes, at regulerende myndigheder som den amerikanske fødevare- og narkotikadministration har strenge standarder, forskerne forpligter sig til omhyggeligt at analysere deres plasmider, før de bruger dem i klinikken.

Nakai siger, at gennemgangen af ​​plasmider for fejl ved sekventering kunne trække forskerne opmærksomme på de problemer, der blev fremhævet i undersøgelsen. Nogle virksomheder, herunder Plasmidsaurus i Eugene, Oregon og Elim Biopharmaceuticals i Hayward, Californien, tilbyder plasmid -sekventering for omkring $ 15,00 pr. Prøve, siger Nakai, der ikke har nogen økonomisk interesse i begge virksomheder. Han anbefaler også, at nye laboratoriearbejdere bruger tid på at lære af erfarne plasmiddesignere; Det er en kedelig, manuel proces, siger han, men hvis du begår en fejl, kan han spilde en enorm mængde tid og penge.

En anden måde for laboratorier at undgå problemer er at gøre dine plasmidsekvenser i open access-lagre offentligt tilgængelige, siger Melina Fan, Chief Scientific Officer for non-profit-organisationen Addgenene i Watertown, Massachusetts. Addgene tilbyder et sådant lager, siger fan og "sekvenser det lagrede plasmid og kommunikerer sekvensdataene via webstedet til brug for samfundet". Det er vigtigt at kontrollere plasmider.

Lahn håber, at analysen af ​​hans team instruerer forskernes opmærksomhed på det faktum, at disse arbejdsdyrlaboratorieværktøjer ofte tages for givet. ”Værktøjets helbred er noget, som folk ikke tænker på,” siger han, selvom de skulle.