laboratoř -made plasmid, pracovní kůň v moderní biologii, má problémy. Vědci provedli systematické vyhodnocení kruhových struktur DNA analýzou více než 2 500 plasmidů, které byly produkovány v laboratořích, a poslány společnosti, která nabízí služby, jako je zabalení struktur v virech, aby mohly být použity jako genové terapie. Tým zjistil, že téměř polovina chyb návrhu plasmidu měla, včetně chyb v sekvencích, které jsou zásadní pro expresi terapeutického genu. Vědci zveřejnili své výsledky minulý měsíc na serveru Preprint Biorxiv

1 .

Studie odhaluje „nedostatek znalostí“ o implementaci plazmidů v laboratoři, říká Hiroyuki Nakai, genetik na zdravotnické a vědecké univerzitě v Oregonu, který nebyl do práce zapojen. Už si všiml problémů s plazmidy vytvořenými v laboratoři, ale byl překvapen frekvencí chyb uvedených studií. Pravděpodobně existuje mnoho vědeckých prací, které byly zveřejněny, pro které nejsou výsledky reprodukovatelné kvůli chybám v návrhu plazmidu, dodává.

zbytečný čas

plasmid jsou oblíbené nástroje v biologických laboratořích, protože bakterie, včetně rozšířeného modelového organismu escherichia coli , používají struktury pro ukládání a výměnu genů. To znamená, že biologové mohou produkovat návrhářský plazmid, který obsahuje různé zajímavé geny, a poté e. Coli je může přesvědčit, aby je zaznamenali a vytvořili mnoho kopií.

Bruce Lahn, hlavní vědec ve společnosti VectorBuilder, společnost se sídlem v Chicagu v Illinois, poskytuje nástroje pro doručování genů, říká, že on a další biologové si po léta zaznamenali problémy s kvalitou plazmidu. Když byl Lahn profesorem na University of Chicago, doktorský student strávil ve své laboratoři šest měsíců za reprodukci dvou plasmidů, které byly hlášeny ve vědecké literatuře. „Nepřemýšleli jsme o kvalitě plasmidu, ale pak experiment nefungoval“, protože chyby plasmidu obsahovaly, říká.

Nyní ve VectorBuilder Lahn říká, že je s problémem neustále konfrontován - tak se rozhodl systematicky vyhodnotit. Když zákazníci předloží vadný plazmid, „ztrácí spoustu času“ a další kroky v kontrole kvality zvyšují náklady na výrobu plasmidu a jejich balení v virech, říká.

Analýza týmu VectorBuilder vyústila v smorgasbord chyb ve více než 2 500 plasmidech. Některé obsahovaly geny, které kódovaly proteiny, které pro e. Coli byli jedovatý, což znamená, že by mohli zpomalit nebo zastavit růst organismů, na biology, aby replikovali své plazmidy. Ostatní, kteří byli určeni pro balení v virech kódovaných proteinech, které byly pro tyto viry jedovaté. A některé obsahovaly opakující se sekvence DNA, které se mohou akumulovat v mutacích plazmidu.

Přezkum chyb

Nejběžnější chyby zjistily, že Lahn a jeho kolegové byli spojeni s klíčovým nástrojem pro genovou terapii. Terapie jsou často zabaleny do adeno-asociovaných virů (AAV), které jsou do značné míry neškodné a mohou transportovat ošetření do buněk. Při produkci plasmidu pro tyto výzkumníky sendviče AAVS, terapeutický gen mezi sekvencemi, které jsou označovány jako ITRS a hrají klíčovou roli při zajišťování toho, aby byl gen zabalen do viru pro dodání. Tyto sekvence v podstatě vysílají biologický signál buněk, který říká „patřím k tomuto viru“. Tým však zjistil, že asi 40% plasmidů AAV ve studii mělo mutace v regionech ITR, které by mohly tuto důležitou zprávu falšovat. Pokud vědci použili tento nesprávně navržený plasmid, jejich genová terapie by nemohla fungovat-mohlo by trvat dlouho, než vědci zjistí, proč.

Mark Kay, specialista na pediatriku a genetiku na Stanford School of Medicine v Kalifornii, také viděl, že plazmidové poruchy mohou zpozdit laboratorní projekty. Je však přesvědčen, že vědci mohou tyto chyby poznat a napravit. Říká, že vědci z genové terapie znají možné problémy ITR a že chyby v klinickém prostředí jsou nepravděpodobné. Je to proto, že regulační úřady, jako je americká správa potravin a léčiv, mají přísné standardy, vědci se zavázají pečlivě analyzovat své plasmidy, než je použijí na klinice.

Nakai říká, že přehled plazmidů pro chyby sekvenováním by mohl vědci uvědomit problémy zdůrazněné ve studii. Některé společnosti, včetně Plasmidsaurus v Eugene, Oregonu, a Elim Biopharmaceuticals v Hayward v Kalifornii, nabízejí sekvenování plazmidu za zhruba 15,00 USD za vzorek, říká Nakai, který nemá o obě společnosti žádný finanční zájem. Doporučuje také, aby noví laboratorní pracovníci trávili čas učení od zkušených návrhářů plazmidů; Je to únavný, manuální proces, říká, ale pokud uděláte chybu, může ztrácet obrovské množství času a peněz.

Dalším způsobem, jak se laboratoře vyhnout problémům, je zpřístupnit vaše plazmidové sekvence v úložišti otevřeného přístupu, říká fanoušek Melina, hlavní vědecká ředitelka neziskové organizace Addgenene ve Watertown, Massachusetts. Addgene nabízí takové úložiště, říká Fan a „Sekvence uložený plazmid a komunikuje sekvenční data prostřednictvím webu pro použití komunitou“. Je důležité kontrolovat plazmidy.

Lahn doufá, že analýza jeho týmu nasměruje pozornost vědců na skutečnost, že tyto laboratorní nástroje pro pracovní zvířata jsou často považovány za samozřejmost. „Zdraví nástroje je něco, o čem lidé nemyslí,“ říká, i když by měli.