Лабораторно-инженерните плазмиди, работен кон от съвременната биология, имат проблеми. Изследователите проведоха систематична оценка на кръговите ДНК структури, като анализираха повече от 2500 плазмиди, направени в лаборатории и изпратени до компания, която предоставя услуги като опаковане на структурите във вирусите, така че те да могат да бъдат използвани като генни терапии. Екипът установи, че почти половината от плазмидите имат грешки в дизайна, включително грешки в последователности, критични за експресията на терапевтичен ген. Изследователите публикуваха своите резултати миналия месец на Preprint Server Biorxiv 1.

Проучването излага "липса на познания" за провеждането на подходящ контрол на качеството на плазмидите в лабораторията, казва Хироюки Накай, генетик от здравен и научен университет в Орегон, който не е участвал в работата. Той вече беше забелязал проблеми с лабораторните плазмиди, но беше изненадан от честотата на грешките, разкрити от изследването. Вероятно има много научни документи, които са публикувани, за които резултатите не са възпроизводими поради грешки в плазмидния дизайн, добавя той.

Изгубено време

Плазмидите са популярни инструменти в лабораториите по биология, като бактерии, включително широко използвания моделен организъмEscherichia coli, които използват структури за съхраняване и обмен на гени. Това означава, че биолозите могат да създават дизайнерски плазмиди, които съдържат различни гени от интерес, и след товаE.Coliубедете ги да ги запишат и да направят много копия от тях.

Брус Лан, главен учен от Vectorbuilder, компания в Чикаго, базирана в Илинойс, която предоставя инструменти за доставка на ген, казва, че той и други биолози са забелязали проблеми с качеството на плазмид от години. Когато Лан е професор в Чикагския университет, аспирант в своята лаборатория прекара шест месеца, възпроизвеждайки две плазмиди, за които се съобщава в научната литература. „Не мислехме за качеството на плазмидите, но тогава експериментът не работи“, защото плазмидите съдържат грешки, казва той.

Сега във Vectorbuilder Лан казва, че вижда проблема през цялото време - затова реши систематично да го оцени. Когато клиентите представят дефектни плазмиди, „те губят много време“, а допълнителните стъпки в контрола на качеството увеличават разходите за производство на плазмиди и опаковане на вируси, казва той.

Анализът на екипа на VectorBuilder разкри хитрост от грешки в оценените над 2500 плазмиди. Някои съдържат гени, които кодират протеини, отговорни заE.Coliбяха токсични, което означава, че могат да забавят или спрат растежа на организмите, на които биолозите разчитат, за да възпроизведат своите плазмиди. Други, предназначени за опаковане във вируси, кодирани протеини, които са токсични за тези вируси. И някои съдържат повтарящи се ДНК последователности, които могат да натрупват мутации в плазмиди.

Проверка на грешки

Най -често срещаните грешки, които Лан и неговите колеги са открити, са свързани с ключов инструмент за генна терапия. Терапиите често са опаковани в адено-асоциирани вируси (AAVs), които са предимно безобидни и могат да доставят лечение на клетки. Когато създават плазмидите за тези AAV, изследователите сандвич са терапевтичен ген между последователности, наречени ITR, които играят критична роля за гарантирането на гена е опакован във вируса за доставка. Тези последователности по същество изпращат биологичен сигнал на клетки, на които се казва „Принадлежа към този вирус“. Екипът обаче установи, че около 40% от AAV плазмидите в изследването са имали мутации в ITR регионите, които биха могли да изкривят това важно послание. Ако изследователите са използвали тези неправилни плазмиди, тяхната генна терапия може да не работи - и може да отнеме много време на учените да разберат защо.

Марк Кей, специалист по педиатрия и генетика в Медицинското училище в Станфорд в Калифорния, също видя от първа ръка, че плазмидните грешки могат да забавят лабораторните проекти. Той обаче е уверен, че учените могат да идентифицират и коригират тези грешки. Той казва, че изследователите на генната терапия са наясно с възможни проблеми с ITR и че грешките са малко вероятно в клинични условия. Това е така, защото регулаторните агенции като Американската администрация по храните и лекарствата имат строги стандарти, които изискват изследователите внимателно да анализират своите плазмиди, преди да ги използват в клиниката.

Накай казва, че проверката на плазмиди за грешки чрез секвениране може да предупреди изследователите за проблемите, подчертани в проучването. Някои компании, включително Plasmidsaurus в Юджийн, Орегон и Elim Biopharmaceuticals в Хейуърд, Калифорния, предлагат секвениране на плазмиди за около 15,00 долара за проба, казва Накай, който няма финансов интерес към нито една от компаниите. Той също така препоръчва новите членове на лабораторията да прекарват време за учене от опитни плазмидни дизайнери; Това е трудоемък, ръчно изработен процес, казва той, но ако направите грешка, той може да губи огромно количество време и пари.

Друг начин лабораториите да избегнат проблеми е да направят своите плазмидни последователности публично достъпни в хранилища с отворен достъп, казва Мелина Фен, главен научен директор в нестопанската Addgene в Уотъртаун, Масачузетс. Addgene предоставя такова хранилище, казва фен, и той „последователности на депозираните плазмиди и споделя данните за последователността чрез уебсайта за използване на общността“. Проверката на плазмидите е важна, добавя тя.

Лан се надява анализът на неговия екип да привлече вниманието на изследователите към факта, че тези лабораторни инструменти за работни кончета често се приемат за даденост. „Здравето на инструмента е нещо, за което хората не мислят“, казва той, въпреки че трябва.